Hoofdstuk 1: microscopische technieken en weefselvoorbereiding
Gemiddelde cel:
RBC: 6 micrometer
Mitochondriën: 1 micrometer
Microscopen:
Antoni Van Leeuwenhoek (één lens)
3 functies
1) Vergroot beeld van het specimen produceren
2) Details in het beeld scheiden
3) Details waarneembaar maken voor het oog of een ander waarnemingsapparaat
Blote oog: min 100-200 µm
Moderne lichtmicroscoop: tot 0.2 µm
EM: tot 0.1 nm
Samengestelde microscoop: minimaal 2 lenzen
Resolutie:
Scheidend of oplossend vermogen
Kleinste afstand waarbij nog net 2 punten kunnen gescheiden worden
Afhankelijk van lenskwaliteit en golflengte
R = λ /NA
➔ Verschil EM en LM
Waarbij λ = golflengte en NA = numerieke apertuur, kwaliteitswaardemeter (<1.4)
NA= n x sin µ
Waarbij n = brekingsindex en µ = halve tophoek
1
,Weefselvoorbereiding:
Meestal -> uitstrijkje van cellen
In de histologie -> weefselsneden
1) Fixatie door perfusie (via bloedbaan) of immersie (onderdompelen)
Noodzakelijk om degradatie van het weefsel door bacteriën en enzymen tegen te
gaan
Doel: (ultra)structuur bewaren
2) Inbedding in parafine
3) Snijden en opvangen
Mbv van een microtoom, na opvanging gedeparaffineerd
4) Kleuren
Hangt af van gewenste doel: levende cellen, volledige stukjes orgaan, …
Hangt af van soort microscoop
Doel: contrast te bekomen
Lichtmicroscoop:
Wanneer een object zich in het focaal vlak bevindt van een lens zal de afbeelding op
oneindig worden geprojecteerd
Condensor: bundelt het licht op het preparaat
Objectief: vormt tussenbeeld en bepaalt grotendeels de vergroting
Oculair: vergroting van het beeld en projectie op het netvlies
VERGR(tot) = VERGR(obj) x VERGR(Oc)
Preparatie van parafinecoupes:
1) Orgaan fixeren en naspoelen
2) Ontwateren
3) Inbedden in paraffine
4) Microtoomcoupes
5) Opvangen op draagglaasje
6) Drogen
7) Rehydrateren
8) Kleuren
9) Stijgende alchoholreeks
10) Insluiten
Contrastverhogende technieken:
- Kleurstoffen
- …
2
, Andere veel gebruikte microscopische technieken
1) Fasecontrast microscopie
= op de plaats van faseverschillen, kunstmatige helderheidsverschillen worden
aangebracht
2) Donkerveldmicroscopie
= het preparaat wordt belicht zodat er geen ander licht dan van het preparaat zelf in
het beeldveld kan komen. Men ziet het preparaat dus tegen een zwarte achtergrond.
3) Polarisatiemicroscopie
= voor ongekleurd spierweefsel, contrast licht-donker bij spiervezels
4) Differentiaal-interferentie contrast
= fasecontrast
Fluorescentie:
Absorberen met kleine golflengte, en weer uitzenden met grotere
Golflengte emissielicht > excitatielicht (want hogere E, EM)
Fluorochroom heeft excitatie en emissiespectrum
Gebruik:
- Autofluorescentie: pollenkorrels, haar, chloroplasten
- Immunohistochemische kleuringen: antilichamen
- Levende organismen
Functie: structuren en processen te detecteren en visualiseren
➔ Fluorescentiemicroscopie
Excitatiefilter (laat bepaalde golflengten door) -> sperfilter (emissielicht bereikt
oog)
Dichroïsche spiegel:
->staat onder een hoek van 45° ten opzichte van de invallende lichtstraal
waardoor het lange golflengten doorlaat, reflecteert de korte.
->voor microscopen met opvallende verlichting
Confocale microscopie:
Pinholes tegen wazig beeld
1) Aan de pinhole: belicht de regio waar het beeld zal gevormd worden
2) Voor de detector: enkel licht vanuit het focale punt
= confocaal
- Confocale laser scanning microscoop
- Spinning disk confocale microscoop
Transmissie-em:
Gebaseerd op dezelfde basisprincipes
Elektronen = lichtbron
Golflengte elektronen < licht
Vacuüm
Elektromagnetische lenzen
3
Gemiddelde cel:
RBC: 6 micrometer
Mitochondriën: 1 micrometer
Microscopen:
Antoni Van Leeuwenhoek (één lens)
3 functies
1) Vergroot beeld van het specimen produceren
2) Details in het beeld scheiden
3) Details waarneembaar maken voor het oog of een ander waarnemingsapparaat
Blote oog: min 100-200 µm
Moderne lichtmicroscoop: tot 0.2 µm
EM: tot 0.1 nm
Samengestelde microscoop: minimaal 2 lenzen
Resolutie:
Scheidend of oplossend vermogen
Kleinste afstand waarbij nog net 2 punten kunnen gescheiden worden
Afhankelijk van lenskwaliteit en golflengte
R = λ /NA
➔ Verschil EM en LM
Waarbij λ = golflengte en NA = numerieke apertuur, kwaliteitswaardemeter (<1.4)
NA= n x sin µ
Waarbij n = brekingsindex en µ = halve tophoek
1
,Weefselvoorbereiding:
Meestal -> uitstrijkje van cellen
In de histologie -> weefselsneden
1) Fixatie door perfusie (via bloedbaan) of immersie (onderdompelen)
Noodzakelijk om degradatie van het weefsel door bacteriën en enzymen tegen te
gaan
Doel: (ultra)structuur bewaren
2) Inbedding in parafine
3) Snijden en opvangen
Mbv van een microtoom, na opvanging gedeparaffineerd
4) Kleuren
Hangt af van gewenste doel: levende cellen, volledige stukjes orgaan, …
Hangt af van soort microscoop
Doel: contrast te bekomen
Lichtmicroscoop:
Wanneer een object zich in het focaal vlak bevindt van een lens zal de afbeelding op
oneindig worden geprojecteerd
Condensor: bundelt het licht op het preparaat
Objectief: vormt tussenbeeld en bepaalt grotendeels de vergroting
Oculair: vergroting van het beeld en projectie op het netvlies
VERGR(tot) = VERGR(obj) x VERGR(Oc)
Preparatie van parafinecoupes:
1) Orgaan fixeren en naspoelen
2) Ontwateren
3) Inbedden in paraffine
4) Microtoomcoupes
5) Opvangen op draagglaasje
6) Drogen
7) Rehydrateren
8) Kleuren
9) Stijgende alchoholreeks
10) Insluiten
Contrastverhogende technieken:
- Kleurstoffen
- …
2
, Andere veel gebruikte microscopische technieken
1) Fasecontrast microscopie
= op de plaats van faseverschillen, kunstmatige helderheidsverschillen worden
aangebracht
2) Donkerveldmicroscopie
= het preparaat wordt belicht zodat er geen ander licht dan van het preparaat zelf in
het beeldveld kan komen. Men ziet het preparaat dus tegen een zwarte achtergrond.
3) Polarisatiemicroscopie
= voor ongekleurd spierweefsel, contrast licht-donker bij spiervezels
4) Differentiaal-interferentie contrast
= fasecontrast
Fluorescentie:
Absorberen met kleine golflengte, en weer uitzenden met grotere
Golflengte emissielicht > excitatielicht (want hogere E, EM)
Fluorochroom heeft excitatie en emissiespectrum
Gebruik:
- Autofluorescentie: pollenkorrels, haar, chloroplasten
- Immunohistochemische kleuringen: antilichamen
- Levende organismen
Functie: structuren en processen te detecteren en visualiseren
➔ Fluorescentiemicroscopie
Excitatiefilter (laat bepaalde golflengten door) -> sperfilter (emissielicht bereikt
oog)
Dichroïsche spiegel:
->staat onder een hoek van 45° ten opzichte van de invallende lichtstraal
waardoor het lange golflengten doorlaat, reflecteert de korte.
->voor microscopen met opvallende verlichting
Confocale microscopie:
Pinholes tegen wazig beeld
1) Aan de pinhole: belicht de regio waar het beeld zal gevormd worden
2) Voor de detector: enkel licht vanuit het focale punt
= confocaal
- Confocale laser scanning microscoop
- Spinning disk confocale microscoop
Transmissie-em:
Gebaseerd op dezelfde basisprincipes
Elektronen = lichtbron
Golflengte elektronen < licht
Vacuüm
Elektromagnetische lenzen
3
