Samenvatting Moleculaire Diagnostiek 2

Samenvatting moleculaire
diagnostiek 2
Les 1
Inleiding
3 mogelijke soorten mutaties (veranderingen in het genoom):

Er wordt gesproken van een mutatie wanneer DNA-polymerase een fout maakt bij het kopiëren van
de sequentie.

1. Punt mutatie (single nucleotide polymorphisms (SNP):
 Silence mutatie: het blijft hetzelfde aminozuur
 Missense mutatie: Het aminozuur veranderd
 Nonsense mutatie: Er word een stopcodon gevormd of er verdwijnt een stopcodon.
2. Kleine schaal mutaties:
 insertie: er komt een nucleotide bij.
 deletie: er is een nucleotide af.
3. Grote schaal mutaties:
 Amplificaties, bijv. gen duplicaties
 chromosoom translocaties

Begrippen:

• Substitutie: één nucleotide is vervangen door één andere nucleotide

• Deletie: één of meerdere nucleotides niet aanwezig zijn

• Duplicatie: een kopie van één of meerdere nucleotides is geplaats op precies 3’ van de
originele kopie van de sequentie

• Insertie: één of meerdere nucleotides zijn geplaatst in een sequentie en deze nucleotides zijn
geen kopie van de nucleotiden direct 5’

• Deletie-insertie (indel): één of meerdere nucleotides zijn vervangen door een of meerdere
andere nucleotiden, en het geen substitutie, inversie of conversie is

• Inversie: meer dan 1 nucleotides vervangen de originele sequentie en deze sequentie is de
reverse-complement van de originele sequentie (bijv CTCGA naar TCGAG)

• Conversie (een specifieke indel): een reeks nucleotiden van de originele sequentie is
vervangen door een reek nucleotiden van een homologe sequentie op een andere plek van
het genoom

• Translocatie: de sequentie van een chromosoom is samengevoegd met dat van een ander
chromosoom



Karyotypering:
Kan translocaties of een afwijkend aantal chromosomen (aneuploïdie) detecteren.

,Hybridisatie FISH:
Dubbelstrengs DNA wat de target sequentie bevat wordt gedenatureerd met behulp van verhitting.
Tijdens renaturatie van DNA hecht de probe aan de complementaire sequentie in het DNA. Deze
probe heeft een fluorescent label die zichtbaar gemaakt kan worden om zo de target sequentie aan
te tonen.

PCR:
Detectie van kleine hoeveelheden DNA/RNA.

PCR-cyclus

1. Denaturatie

94C

2. Annealing

Hybridisatie van primers

Ta = Tm - 5

Stringentie wordt met name door
temperatuur bepaald.

3. Elongatie

72C

Beëindiging




Reverse transcriptase PCR (RT-PCR): mRNA wordt eerst omgezet in cDNA om het te kunnen meten.

Detectiemethoden:

- Direct
 Absorptie bij 260 nm
 Fluorescerende kleurstoffen ethidiumbromide, Midori green
- Indirect
 Hybridisatie met probes
 Immunologisch met antilichamen



Scheidingstechnieken:

- Elektroforese
 Southern blot (DNA)
 Northern blot (RNA)

, - DNA sequencing
 Sanger sequencing



Southern blot:

Maakt een analyse van elk specifieke gen of gebied mogelijk, zonder het te moeten scheiden van een
complexe achtergrond.

1. DNA-extractie (DNA isoleren uit cellen)
 cel openbreken, lipiden verwijderen, neerslaan van het opgeloste DNA.
2. Knippen van het DNA (in kleinere fragmenten m.b.v. restrictie-enzymen)
 Restrictie endonuclease
3. Scheiden van DNA-fragmenten door Gelelektroforese en denaturatie in zuur (HCl)
 Zodat grotere fragmenten denatureren
4. Overbrengen naar nitrocellulose filter (blotten)
 Zorgt voor immobilisatie (DNA bindt aan filter)  wanneer je DNA op de gel houdt loopt
het DNA over de gel heen. Het membraan wordt geblokkeerd met magere melk of BSA, zodat
de probe specifiek bindt aan het DNA.222222
5. Prehybridisatie, Was de probe  zorgt ervoor dat de probe alleen bindt aan specifieke
plekken waardoor er minder ruis ontstaat
 zalmsperma DNA of gist tRNA.
6. Hybridisatie  Met gelabelde probe, geeft kleur aan buffers.
7. Wassen  Verwijdert niet specifiek gebonden probe
8. Detectie van gebonden probe (X-Ray film)
9. Eventueel “herproben”



SANGER-sequencing (ketenterminatie methode):

 Polymerase reactie, die op verschillende momenten wordt gestopt zodat de laatste
nucleotide afgelezen kan worden
 Polymerase reactie met 1 primer (wordt 1 lineaire kopie gevormd)
en ddNTP’s hebben geen 3’OH-groep waardoor er geen fosfodi-ester binding gevormd kan
worden en hierdoor kunnen er geen nucleotiden aan elkaar gekoppeld worden
 ketenterminatie (Nucleotiden koppelen niet en liggen dus los)
 Er wordt Taq-polymerase gebruikt: geen 3’exonuclease (dus geen tsjak!)
 Manuele DNA sequencing: 4 reactie tubes met gelabelde radioactieve primer, alle dNTP’s en
1 soort ddNTP.
 Dye terminator sequencing: single-tube reactie, elke ddNTP zijn eigen fluorchroom (kleur).



Voorbeeld tentamenvraag:

Sequentie van dit fragment (van onder naar boven)

5’ TCCTAAGTCCTCCGG 3’
Geproduceerde

Oorspronkelijke template:

, 3’ GGCCTCCTGAATCCT 5’




Les 2
Genetische afwijkingen:
Ziekte van Huntington

 Neurodegeneratieve aandoening
 Het afsterven van de zenuwcellen.
 Eerste symptomen 35-45 levensjaar
 Onwillekeurige bewegingen,
stemmingswisselingen
 Psychische problemen, emotionele
problemen
 Dementie, spieruitval
 De ziekte is autosomaal-dominant
overdraagbaar, toch kan je ook drager
zijn.
 Mutaties op het huntington gen, meerdere repeats.
 De lengte van deze repeats is bepalend hoe erg de ziekte is en of je drager bent.
 onder de 28 repeats is normaal.
 vanaf 28 tot 35 repeats ben je onstabiel
 36-39 repeats, dan heb je het huntington gen, maar met verminderde klachten. (drager)
 40 of meer repeats dan heb je het huntington gen.
 Lengte wordt bepaald met PCR, met fluorescent gelabelde primers aan beide uiteindes van
de CAG repeat en het wordt gescheiden en gedetecteerd op acrylamide gel of met capillaire
elektroforese.
Het zijn maar ongeveer 100 bp en dat is te klein voor op een agarose gel.



Hemochromatose:

 Autosomaal recessieve aandoening.
 Er zit een mutatie in gen voor HFE-eiwit:
C282Y
 Bij de C282Y mutatie wordt in het HFE-
eiwit het 282e aminozuur cysteïne
vervangen door tyrosine.
 HFE is de ijzersensor in de dikke darm
 Door deze mutatie wordt er te veel ijzer
geabsorbeerd uit eten
 In normaal gen zit 1 knipplek voor Rsa1,
in mutant 2 plekken.
 RsaI knipt op 240 bp, en in mutant ook
op 270 bp