Samenvatting Gentechnologie (I0O11A)

H1: Isolatie en visualisatie
nucleïnezuren
1. Inleiding
 G en C: 3 H-bruggen A en T: 2 H-bruggen
 Atomische modificaties isotopisch labelen
(emitteren β-straling): 31P  32P/33P, 14N 
15N, 12C  13C/14C, H  3H
 Bij DNA-replicatie: desoxyribonucleotidetri-P
molecule wordt herkend obv template strand 
chemische reactie met vrijstelling pyrofosfaat
 DNA-polymerase kan geen 5’ uiteinde verlengen
 Hershey & Chase (1952): enkel DNA van faag gaat in cel  DNA bevat alle info nodig voor
reproductie van nieuwe bacteriofaagpartikels

2. Isolatie van nucleïnezuren
Globale doelstellingen van gentechnologische bewerkingen:

1. EXPLORATIE: analyse van genoom en signalen
 Prenatale diagnose, microbiologische analyses, virusidentificatie
2. GEBRUIK: expressie van eiwit in grote hoeveelheid
 Industriële productie (interferonen, insuline, agarose, amylase)
3. DESIGN: gerichte wijziging van organisme in omgeving
 Biotechnologie: inbouw nieuwe eigenschappen

Middelen voor isolatie:

Inhibitie biochemische activiteiten Snelle verwijdering nucleïnzuur van rest
- EDTA - Fenol, chloroform
- Temperatuur verlagen - Gebruik ethanol, isopropanol, PEG,
- Eiwitdenaturerende agentia spermidine, CTAB
toevoegen - Qiagen, Glassmilk (dragers waarop
nucleïnezuur bindt)
Guanidiumzouten DEPC (di-ethylpyrocarbonaat)
Chaotroop agens: vernietingt 3D-structuur Sterk alkylerend agens
 guanidium HCl: sterke inhibitor RNase  ethoxyformylering van histidylgroepen
 guanidiumisothiocyanaat: nog sterker  behandeling glaswerk en oplossingen
VRC (vanadylribonucleoside complex) Proteïne-inhibitoren van RNase
 bindt aan actieve plaats RNasen en  uit cytoplasma van bijna alle
inhibeert katalytische activiteit zoogdierweefsels
 gebruikt bij mRNA isolatie voor cDNA  RNAsin, prime inhibitor
klonering




1

, A. Bereiden van bacterieel DNA

1. Nood aan voldoende biomassa  groeimedium met
bacteriën
2. Cel lysis  cel extract
3. Centrifugatie  cell pellet (precipitatie) verwijderen 
DNA, RNA en proteine in suspensie
4. Celextract mengen met phenol  scheiden in 2 lagen na
centrifuge (fenol is zwaarder)  DNA in suspensie,
proteinen op interface

Cellysis met E. coli als waardcel:
A. Cleared lysate methode
1. EDTA + lysozyme + 25% sucrose toevoegen aan cel
 EDTA vormt complex met ionen  destabiliseren
buitenmembraan
 Lysozyme breekt peptidoglycaanlaag af
 Bacteriecel spat niet uiteen door 25% sucrose
2. Triton X-100 toevoegen aan sferoplast (geeft prikje aan cel)  celextract
3. Centrifugeren  troebele zone heeft DNA (supercoiled en open-circular) + lysaat heeft
plasmiden
B. Alkalische lysis methode (plasmide opzuivering)
1. Op en neer pipetteren  chromosomaal DNA breekt in stukken (lineaire DNA
fragmenten + supercoiled plasmide)
2. Bij pH 12: chromosomaal DNA denatureert  single stranded
3. pH 7: DNA-fragmenten vinden elkaar niet terug  niet-georganiseerde massa
4. Centrifuge  pellet van lineaire DNA-moleculen + plasmiden in oplossing
C. Kooklyse
Ruwe procedure  cellen barsten open door verhitting
D. Fenollyse
Alternatieve zeer ruwe methode (enkel geschikt voor snelle karakterisatie)

B. Opzuivering van faag DNA
Fagenpartikels zijn te klein, blijven in suspensie  cellen en debris precipiteren
1. Faagsuspensie  PEG + zout toevoegen  faagpartikels precipiteren
2. Centrifuge  onzuiverheden in suspensie verwijderen  dichtheidgradientcentrifugatie
3. CsCl in kolom gedeponeerd in verschillende conc  gelaagdheid
4. Faagpartikels volgen densiteit en gaan op specifieke densiteit stabiliseren (afhankelijk van
verhouding eiwit/DNA)  faagpartikels opzuiveren

C. CTAB methode voor isolatie plant DNA
Extratie DNA aan hoge kwaliteit waarbij minimaal DNA wordt gebroken
1. CTAB, TrisHCl, EDTA, NaCl, BME en proteinase K toevoegen aan celextract
2. CTAB treedt in complex met nucleinezuren en precipiteert (bij lage zoutconc)
3. Centrifuge (nucleinezuur-CTAB in pellet)  supernatans verwijderen
4. Resuspenderen aan hoge zoutconcentratie  DNA terug in oplossing
5. DNA zuiveren door eenvoudige stappen

D. DNA opzuivering



2

, A. Geconc DNA-oplossing met absolute ethanol  ethanol opleggen  DNA precipitatie op
interface  met glazen staaf isoleren
B. Aan 1 volume DNA 2.5x zoveel ethanol toevoegen in zoutomstandigheden  DNA
precipiteert  resuspenderen in volume naar keuze
C. Silicapartikels die door guanidium thiocyanaat (GTC) binden aan DNA  silica in kolom 
celextract erover  biochemische molecules elueren  toevoegen water  DNA in apart
recipient
D. IEX met + partikels  interageren met – DNA  zout toevoegen  RNA vrij van kolom 
hoge zoutconcentratie  DNA komt vrij
 Conventionele anion-exchangers: DEAE kern die gekoppeld is aan suikermolecules (20 A
uit elkaar): + lading die interageert met P-backbone
 Verbeterde anion-exchangers: afstand DEAE dichter bij elkaar

E. Spectrofotometrische zuiverheidsbepaling van nucleïnezuren
 Snelle, niet destructieve meting van nucleïnezuren
 Geen onderscheid tussen DNA en RNA (RNase-vrij DNa om contaminerend DNA te
verwijderen)
 Verhouding absorbantie 260/280 nm  zuiverheid DNA en RNA bepalen
Ratio van 1.8 Zuiver DNA
Ratio van 2.0 Zuiver RNA
Ratio < 1.8 Eiwit, fenol of andere contaminanten



3. Scheiding en detectie van nucleïnezuren
A. Agarose gelelectroforese

PARAMETERS DIE MIGRATIESNELHEID BEÏNVLOEDEN:

1. Agaroseconcentratie
 alternerende D- en L-(3-6-anhydro)galactose, gekoppeld door a(1-3) en b(1-4)
glycosidische bindingen  vormt 3D-structuur
 INVERS LINEAIR VERBAND TUSSEN LOG ELEKTROFORETISCHE MOBILITEIT EN
GELCONCENTRATIE
2. Moleculaire grootte
 MIGRATIESNELHEID IS OMGEKEERD EVENREDIG MET LOG RELATIEVE MOLECULAIRE
MASSA
 Voor grote DNA-fragmenten: hogere resolutie voor lage densiteit
3. Conformatie DNA
 Supercoiled is kleiner dan genikte open circulaire  sneller door matrix
 Ethidiumbromide: lading daalt; DNA minder flexibel en langer
4. Aangelegde voltage
 Typisch 5 volt per cm lengte van de gel
 Hoe hoger voltage, hoe harder DNA trekt naar + kant
 Te hoog: warmteproductie die gel doet smelten (minder zuiver)
 Low melting agarose: door hydroxy-ethylatie
 Metaphor agarose: hogere resolutie (kleinere fragmenten)

1. DNA scheiden door GE  gewenste fragment uitsnijden met scalpel
2. Agarose oplossen + mengen met silica dat chaotropisch zout bevat
3. DNA bindt aan silica matrix  onzuiverheden verwijderd door eenvoudige wasstappen

3

, 4. DNA elueren uit matrix door buffer met lage zoutconcentratie

B. Staining DNA

Intercalatie in ds-DNA is redelijk stabiel: verwijdering door diffusie is moeilijk  extractie met
butanol & iso-amylalcohol of via IEX

Ethidium bromide SYBR SYBR gold
Intercaleert tussen basenparen Asymmetrische cyanine kleur Relatief duur
Specifiek absorbantie en Geen fluorescentie in - gevoelig aan fluorescent licht
emissiespectrum oplossing, wel bij binding aan - gouden kleur
DNA/RNA
Staining: DNA in een gel bad in Gevoeliger dan EtBr: - 10x meer gevoelig
buffer met EtBr  fixatie in - niet fotostabiel - redelijke gelpenetratie
DNA & nabijheid baseringen - slechte gelpenetratie - bindt mogelijk aan
verhogen fluorescentie - niet optimaal bij 300nm fosfaatruggengraat  sterke
Toegevoegd wanneer gel vertraging en beïnvloeding van
wordt gegoten (vertraagd mobiliteit
migratiesnelheid + minder
duidelijke bandjes)
Destaining: in water of 1 mM
MgSO4
Zorgt voor foto-oxidatie van
DNA bij licht en O2
Mutagene stof
Bindt ook ss nucleinezuren 
zwakkere fluorescentie


C. Gelvrije detectie van nucleinezuren

 Microfluida, CE en fluorescente kleurstoffen  RNA/DNA concentratie en integriteit bepalen
 Heel gevoelig + precies

D. Pulsed-Field Gel Electrophorese (PFGE)

 Grote fragmenten scheiden tot 10 Mb
 Grote DNA-molecules ontrafelen en bewegen als slang doorheen gel
 Hoe groter molecule, hoe moeilijker herorientatie
1. Elektrisch veld leggen op A  molecule migreert naar rechtsboven (beweegt als slang)
2. Stroom stilleggen  stroom over B  DNA herorienteert en beweegt naar links
3. Herhaling  vorming zigzagbeweging
 PROBLEEM: fysisch lange, grote moleculen  leggen fysische stress op en kunnen
breken  cellen worden gelyseerd terwijl ze in agarose zitten, daarna rechtstreekse
scheiding

E. Immobilisatie van nucleïnezuren

 Northern blot (RNA)/ Southern blot (DNA)/ Western blot (proteïne)
 Afdruk en immobilisatie op cellulosenitraatmembraan  kunnen versterkt worden met
polyester nylonmembranen
 Capillaire transfer electro-blotting  vacuumblotting



4