Samenvatting Moleculaire Biologie (GoO53C)

H1: De moleculaire aard van
genen
Geschiedenis
1. 1869: MIESCHER isoleerde nuclei uit etter  vond fosforbevattende substantie (nucleine)
2. Einde van 19e eeuw: DNA en RNA gescheiden van proteïnen
3. 1910 – 1930: LEVENE karakteriseerde compositie van DNA/RNA: fosfaat + (deoxy)ribose
suiker + 4 verschillende bases
 Belang van basensequentie nog niet ingezien
 PROTEINEN, NIET DNA IS HET GENETISCH MATERIAAL
 Tetranucleotide hypothese: fosforgroepen aan elkaar ipv aan de suiker
4. 1928: GRIFFITH deed aan bacteriële transformatie  transformatie van component van
heat-killed virulente strain naar non-virulente strain
5. 1944: AVERY, MACLEOD & MCCARTY vinden dat het getransformeerde materiaal DNA is 
geen virulentie meer na behandeling met DNase
 DNA, NIET PROTEINE IS HET GENETISCH MATERIAAL
6. 1952: HERSHEY & CHASE vinden dat bacteriofaaginfectie van DNA komt  gelabeld S-eiwit
komt niet in cel voor, maar gelabeld P-DNA komt voor in cel
7. 1953: WATSON & CRICK vinden dubbele helixstructuur van DNA

Chemische natuur van nucleïnezuren
 Nucleoside= base + suiker
 Nucleotide= base + suiker + fosfaatgroepen
 FRANKLIN vond helixstructuur van DNA door X-stralendiffractie  data liet repetitieve
structuur zien
 WATSON & CRICK stelden structuur voor als dubbele helix met suiker-fosfaatruggengraat
aan de buitenkant en de bases aan de binnenkant
 Tussen G en C: 3 H-bruggen  vormen major groove (grote afstand tussen suikers)
 Tussen A en T: 2 H-bruggen  vormen minor groove (kleine afstand tussen suikers)

A-helix B-helix Z-helix
Draait rechts Draait rechts Draait links
In dsRNA Meest voorkomend Komt zelden voor
DNA-RNA Chromatine Poly(dGdC)

Nucleinezuur triple-helix
 RNA-molecule met complementariteit aan dubbele DNA-helix laten binden (plaats genoeg in
grote groeve)  geen Watson-Crick, wel Hoogsteen-basepairing
 Kan in parallele en anti-parallele richting
 Rol in chromatine organisatie, DNA repair, transcriptie regulatie en RNA processing

G-quadruplex
 Spontaan gevormd als veel guanine-residues op DNA naast elkaar gelegen zijn + DNA-
polymerase haalt 2 strengen uit elkaar  polymerasen raken erdoor geblokkeerd



1

,EIGENSCHAPPEN IN DNA
 G/C en A/T verhoudingen zijn specifiek per organisme  grote G/C verhouding in
organismen die leven in thermofiele bronnen (steviger aan elkaar)
 Hoog G/C gehalte  hoge smelttemperatuur
 Hoog G/C gehalte hoge densiteit ( DNA scheiding door CsCl2 densiteit gradient
centrifugatie)
 DNA kan gedenatureerd worden door organische solventen (DMSO, formamide), chaotrope
agentia (ureum; neutraliseert H-bruggen), hoge pH (NaOH) en lage zoutconcentratie
(ladingen stoten elkaar af en DNA denatureert)
 Polynucleotideketen hybridizatie: samenvoegen van ssDNA en RNA  northern blotting, S1
mapping, microarrays, FISH
 DNA-grootte meten door elektronenmicroscopie en gelelektroforese
 C-waarde paradox: de genoomgrootte staat los van de complexiteit van individu

Agarose Polyacrylamide
Horizontaal Verticaal
Lage resolutie Hoge resolutie
Natief DNA (niet) denaturerend
100 - >50.000 bp 1-1000 bp
 Kleine fragmenten migreren sneller dan grote fragmenten

DNA renaturation (annealing)
 Afkoelen  complementaire strengen vinden elkaar terug (traag)  ritssluiting (snel)
 DNA kleiner maken door shearing (door sonicatie)  grotere kans dat fragmenten hun
complement terug vinden
 Bij lage zoutconcentratie + bij 20-25 °C

DNA sequencing (Dideoxy chain-termination
sequencing, Sanger)
1. Templatematrijs ssDNA nodig  bindt aan primer die complementair is aan template
2. 4 DNA-bouwstenen en DNA polymerase toevoegen aan staal
3. Radioactief gelabeld ddATP toevoegen (ken geen nieuwe fosfodiesterbinding vormen 
ketenterminatie)
4. Overmaat aan nucleotiden aanwezig  toevallig ddATP ingebouwd  polymerase stopt
5. Bij andere strengen gebeurt stop later/vroeger  collectie fragmenten van verschillende
grootte die eindigen op A
6. Herhalen met ddTTP, ddCTP en ddGTP
7. Elektroforese: fragmenten scheiden met hoge resolutie
8. Bandjes visualiseren met kleurstof
9. Sequentie aflezen van onder naar boven
 NU: capillaire elektroforese (800-1200 basen)


H2: Mechanisme van transcriptie
bij bacteriën
1. RNA polymerase structuur
Ionenuitwisselingschromatografie

2

,  DEAE-cellulose kolom gebruikt voor opzuivering RNA polymerase
 Oplossing eiwitten over kolom gestroomd  - partikels blijven hangen, + gaat erdoor
 - partikels elueren door ionische sterkte te verhogen
 Scheiden volgens grootte met SDS-PAGE

A. RNA polymerase structuur ( Burgess, Travers 1969)

 IEX van E. coli RNA polymerase  SDS-PAGE van A, B en C pieken
 Sigma: specificiteitsfactor + core: katalytische activiteit

B. Transcripti e-(a)symmetrie testen ( Bautz 1969)

 Core enzyme transcribes both DNA
strands
 Without sigma subunit: core enzyme has
basic transcribing ability, lacks specificity



2. Promotoren
C. Nitrocellulose fi lter-binding assay

 Nitrocellulose bindt aan eiwitten, niet
aan ds DNA
 DNA radioactief merken
1. Gemerkt ds DNA verschijnt in filtraat
2. Proteinen blijven aan nitrocellulosemembraan hangen
3. RNApolymerase blijft aan DNA hangen  verschijnt niet in filtraat

D. Binden van RNA polymerase aan promotor ( Hinkle & Chamberlin 1972)

 In vitro binding van gemerkt T7-DNA met holoenzyme/core
 Overschot ongemerkt T7-DNA toevoegen
 Nitrocellulosefilter-binding assay na verschillende periodes
 Holoenzyme bindt DNA sterk
 Core enzyme bindt meer kortstondig

E. Temperatuur en RNA polymerase binding

 In vitro binding van gemerkt T7-DNA met holoenzyme en incubatie bij verschillende T
 RNA polymerase bindt minder aan DNA bij lagere T
 Hogere T promoten RNAP binding (door gemakkelijker DNA smelten)

RNA POLYMERASE/ PROMOTOR BINDING

1. Promotor search: holoenzyme bindt DNA eerst zwak en diffundeert langs DNA
2. Closed promotor complex formation (RPc): complex bindt zwak aan promotor (dsDNA in
gesloten vorm)  lage affiniteit DNA
3. Open promotor complex formation (RPO): holoenzyme smelt DNA bij openen promotor
(polymerase wordt sterk gebonden)

FOOTPRINTING

1. DNA-fragment labelen met radioactieve P-groep

3

, 2. RNA-polymerase toevoegen
3. DNase toevoegen + eiwit verwijderen + DNA denatureren
4. Electroforesefragmenten van verschillende grootte  electroforese
5. Bandenvrije zone: beschermd door eiwit  Sanger

CORE PROMOTER ELEMENTS
A. -10 box (Pribnow box): TAtAaT
B. -35 box: TTGACa
C. UP element: in rRNA  stimuleert transcriptie 30x
 Promoter down mutations= mutations that weaken promoter binding  increased
deviation from consensus sequence
 Promoter up mutations= mutations that strengthen promoter binding  less deviation

3. Transcriptie initiatie
F. Transcripti e initi ati e ( Carpousis 1980)

 In vitro transcriptie van lacUV5 promotor in aanwezigheid gelabeld ATP  denaturerende
PAGE  autoradiografie
 Polymerase begint aan promotor en gaat proefdraaien: produceert abortieve
transcripten

STAPPEN IN TRANSCRIPTIE INITIATIE:

1. Vorming closed promotor complex (RPc): losse binding
2. Omzetting naar open promotor complex (RPO): hechte binding
3. Polymerisatie eerste nucleotiden  polymerase aan promotor (abortieve transcriptie)
4. Promotor clearance: transcript wordt lang genoeg om stabiele hybride te vormen met
templaat
Wanneer komt sigma los van complex?

G. Sigma sti muleert transcripti e initi ati e ( Travers & Burgess 1969)

 In vitro transcriptie van T4 DNA door RNA polymerase core
 Verschillende hoeveelheden σ
 σ stimuleert initiatie en elongatie?
 Elongatie lijdt tot meer C incorporatie
 Rifampicine blockeert initiatie, niet elongatie

H. Reuse of sigma ( Travers & Burgess 1969)

 In vitro transcriptie van T4 DNA door holoenzyme bij lage ionische sterkte (geen RNAP
dissociatie)
 + core (van Rif-resistant RNAP), +/- rifampicin
 σ kan gerecycleerd worden voor initiatie
 rifampicine blokkeert initiatie door met core te interageren

THE σ CYCLE MODEL

 tijdens initiatie: σ kan gerecycleerd worden (σ-cyclus)  core-enzyme laat σ los: dan
geassocieerd met ander core-enzyme
1. Obligate release model: σ dissocieert bij promotor clearance

4