BIOTECHNOLOGIE
H1: BASISTOOLS IN DNA-TECHNOLOGIE
ISOLATIE VAN DNA EN RNA UIT CELLEN OF WEEFSELS
1. ISOLATIE VAN DNA
Principe
Openbreken van cellen en weefsels
- Mechanisch:
o Homogeniseren: manueel/elektrisch
o Soniceren = in sonicatiebad met ultrasone geluidsgolven of met een staaf in vloeistof
o Bead mill = kleine beads die cellen kunnen openbreken
o French press = om plantenmateriaal open te breken
Lysis van celmembranen
- Mechanisch: homogeniseren
- Hitte: vries/dooi cycli, opkoken
- Enzymatisch: proteïnase K weefseldigest
- M.b.v. detergenten: SDS → hydrofiele kop en hydrofobe staart → kan zich tussen de
fosfolipiden settelen → mixed micelle → openingen in celmembraan → inhoud komt vrij
DNA scheiden van de rest van de celinhoud
- Supernatans: DNA
- Pellet: cel debris
Verdere opzuivering
- Afbraak eiwitten (DNase): protease
- Afbraak RNA: Rnase
- Afbraak peptidoglycaanlaag in celwand van G+ bacteriën: lysozyme
- Afbraak polysacchariden, tannines en polyfenolen in plantenextracten
o B-me of DTT: reducerende S-S-bruggen
o Polyvinylpyrrolidone (PVP): inhibeert polyfenolen
- Denaturatie eiwitten
o Ureum of guanidine thiocyanaat: verminderen hydrofobe interacties en verbreken H-
bruggen
- Precipitatie eiwitten, RNA- en celdebris
o Centrifugatie of geconcentreerde zoutoplossing (NH4)2SO4: afhankelijk van grootte en
AZ-samenstelling
- Fenol/chloroform extractie = fase verdeling in fenol/CHCl3 + centrifugatie
o DNA en andere eiwitten scheiden van elkaar adhv 2
verschillende fasen.
1
, - Alcoholprecipitatie = samenklonteren van DNA door onoplosbaarheid in ijskoude ethanol of
isopropanol + centrifugatie: DNA in pellet hier!
- Kolomchromatografie = DNA bindt aan de kolom (anion-uitwisselaar of silicamatrix):
absorptie van DNA aan silica hangt af van de buffer/pH en de zoutconcentratie.
o Wassen
o Elueren = DNA komt los van de matrix
▪ Demi-water
▪ Licht alkalische buffer
Zouten: betere oplosbaarheid van DNA, maar kunnen hinderen bij PCR en sequencing. EDTA: inhibitie
van DNase door binding met Mg2+, maar interferentie met PCR,digest en ligaties Mg2+ vereisen.
Bewaring
Bewaren bij 4°C,-20°C en -80°C (vermijd vries-dooi cycli)
Concentratiebepaling
Absorbantie bij 260 nm: C = A260 . 50
Zuiverheid
A260/A280 = 1,7-2,0 en A260/A230 > 1,5
- A280 = eiwitten (aromatische AZ)
- A230 = organische verbindingen en chaotrope zouten
Isolatie van plasmide DNA
Selectieve alkalische denaturatie van chromosomaal DNA met hoog moleculair gewicht. Gesloten
circulair DNA blijft dubbelstrengig.
Neutralisatie en renaturatie:
- Supernatans: plasmide DNA
- Pellet: gDNA
2. ISOLATIE VAN RNA
Principe
Openbreken van cellen en weefsels
Lysis van de celmembraan, maar hier met een mild detergent (NP40)
RNA scheiden van de rest van de celinhoud
Verdere opzuivering
- Zure fenol-chloroform extractie
o Denaturatie van eiwitten met guanidine thiocyanaat
o Faseverdeling in fenol/CHCl3 → centrifugatie
2
,Opgelet: RNase-vrij werken!! RNase wordt niet geïnactiveerd door autoclaveren. We kunnen RNase
afbreken adhv DEPC. DEPC reageert met het katalytisch histidine in het reactief centrum van RNase =
inhibitie van een enzymatische activiteit. DEPC voor alle waterige oplossingen RNase vrij te maken +
nadien autoclaveren. RNA steeds op ijs houden en steeds werken met handschoenen!
- Ethanolprecipitatie en kolomchromatografie (zie DNA).
Extra
- Toevoegen RNase inhibitoren: RNAlater, RNAsin
- Denaturatie RNasen: guanidine isothiocyanaat
- Elutie in steriel RNAse-vrij water
Total RNA-extract: 95% rRNA, 5% mRNA. Verrijking door mRNA = om hogere concentraties aan
mRNA te bekomen:
- Kolom met silicamatrix: enkel lange mRNA-ketens worden gebonden (>200NT)
- Kolom met affiniteit: oligo (dT)cellulose of poly(U)sepharose: bead met verschillende T NT →
poly-A staart zal hieraan binden.
Bewaring
Bij -20°C of -80°C.
Concentratiebepaling
Absorbantie bij 260nm: C = A260 . 40
Zuiverheid
A260/A280 = 1,7-2,0 en A260/A230 > 1,5
Kwaliteit
Afbraak van RNA? Agarose gel
- Scherpe 18S en 28S ribosomale banden = intact RNA
- Smeer van afgebroken 18S en 28S rRNA = afgebroken RNA
Afbraak van RNA? Bioanalyzer
- Scherpe ribosomale pieken: 18S < 28S = intact RNA
- RIN (RNA integrity number)
o RIN = 10 → intact
o RIN < 10 → afgebroken RNA
3. STABILITEIT DNA VS RNA?
DNA is het meest stabiel omdat het ds is en het heeft geen OH. OH
zorgt voor onstabiliteit.
3
, ENZYMEN DIE INWERKEN OP DNA OF RNA
DNASE I
Dit is een endonuclease die DNA hydrolyseert tot oligonucleotiden. Het
verknipt de verbinding tussen de fosfaatgroep. Toepassing: aantonen van
DNA-bindende eiwitten die DNA beschermen tegen afbraak. DNase I
situeert die EW. Als EW gebonden zijn op die ene plaats dan kan DNase I
daar niet knippen. Footprint te zien:
RNASE
Dit is een endonuclease die RNA hydrolyseert tot oligonucleotiden.
- RNase A = splitst ssRNA aan 3’-C of 3’-U → 3’-fosfaat uiteinde
- RNase H = splitst ssRNA in DNA/RNA-duplex → 5’-fosfaatuiteinde
o Bij aanmaak cDNA
- RNase III = splitst ds 16S en 23S rRNA in operon. Het splitst ook ds pri-miRNA tot matuur
miRNA (DROSHA en DICER)
DNA-POLYMERASE
Komt tepas tijdens PCR en replicatie. Template is ssDNA. Dan pas kan DNA polymerase binden en zijn
werking uitvoeren.
DNA-polymerase I:
- 5’-3’ polymerase-activiteit (extension)
- 5’-3’ exonuclease-activiteit = NT verwijderen
- 3’-5’ exonuclease-activiteit (proofreading = bij een verkeerd ingebouwde NT kan deze nog
verwijdert worden en vervangen worden door een goed NT)
Klenow-fragment:
- Geen 5’-3’ exonuclease-activiteit
- Toepassing: cDNA synthese en DNA sequencing
Thermostabiele polymerase: actief bij 37°C
- Taq DNA-polymerase: geen 3’-5’ exonuclease activiteit → geen proofreading →
replicatiefouten (1/100bp)
- Pfu en Pwo DNA-polymerase: sterk 3’-5’ exonuclease, minder 5’-3’ polymerase → minder
replicatiefouten (1/106)
- Toepassing: Pfu en Pwo in combinatie met Taq voor amplificatie van lange DNA fragmenten
RNA-POLYMERASE
Voor de transcriptie. Template moet ssDNA zijn met promotor.
Indien geen promotor aanwezig, dan kan RNA polymerase niet
werken. Vaak zijn de promotors afkomstig van virussen.
4
H1: BASISTOOLS IN DNA-TECHNOLOGIE
ISOLATIE VAN DNA EN RNA UIT CELLEN OF WEEFSELS
1. ISOLATIE VAN DNA
Principe
Openbreken van cellen en weefsels
- Mechanisch:
o Homogeniseren: manueel/elektrisch
o Soniceren = in sonicatiebad met ultrasone geluidsgolven of met een staaf in vloeistof
o Bead mill = kleine beads die cellen kunnen openbreken
o French press = om plantenmateriaal open te breken
Lysis van celmembranen
- Mechanisch: homogeniseren
- Hitte: vries/dooi cycli, opkoken
- Enzymatisch: proteïnase K weefseldigest
- M.b.v. detergenten: SDS → hydrofiele kop en hydrofobe staart → kan zich tussen de
fosfolipiden settelen → mixed micelle → openingen in celmembraan → inhoud komt vrij
DNA scheiden van de rest van de celinhoud
- Supernatans: DNA
- Pellet: cel debris
Verdere opzuivering
- Afbraak eiwitten (DNase): protease
- Afbraak RNA: Rnase
- Afbraak peptidoglycaanlaag in celwand van G+ bacteriën: lysozyme
- Afbraak polysacchariden, tannines en polyfenolen in plantenextracten
o B-me of DTT: reducerende S-S-bruggen
o Polyvinylpyrrolidone (PVP): inhibeert polyfenolen
- Denaturatie eiwitten
o Ureum of guanidine thiocyanaat: verminderen hydrofobe interacties en verbreken H-
bruggen
- Precipitatie eiwitten, RNA- en celdebris
o Centrifugatie of geconcentreerde zoutoplossing (NH4)2SO4: afhankelijk van grootte en
AZ-samenstelling
- Fenol/chloroform extractie = fase verdeling in fenol/CHCl3 + centrifugatie
o DNA en andere eiwitten scheiden van elkaar adhv 2
verschillende fasen.
1
, - Alcoholprecipitatie = samenklonteren van DNA door onoplosbaarheid in ijskoude ethanol of
isopropanol + centrifugatie: DNA in pellet hier!
- Kolomchromatografie = DNA bindt aan de kolom (anion-uitwisselaar of silicamatrix):
absorptie van DNA aan silica hangt af van de buffer/pH en de zoutconcentratie.
o Wassen
o Elueren = DNA komt los van de matrix
▪ Demi-water
▪ Licht alkalische buffer
Zouten: betere oplosbaarheid van DNA, maar kunnen hinderen bij PCR en sequencing. EDTA: inhibitie
van DNase door binding met Mg2+, maar interferentie met PCR,digest en ligaties Mg2+ vereisen.
Bewaring
Bewaren bij 4°C,-20°C en -80°C (vermijd vries-dooi cycli)
Concentratiebepaling
Absorbantie bij 260 nm: C = A260 . 50
Zuiverheid
A260/A280 = 1,7-2,0 en A260/A230 > 1,5
- A280 = eiwitten (aromatische AZ)
- A230 = organische verbindingen en chaotrope zouten
Isolatie van plasmide DNA
Selectieve alkalische denaturatie van chromosomaal DNA met hoog moleculair gewicht. Gesloten
circulair DNA blijft dubbelstrengig.
Neutralisatie en renaturatie:
- Supernatans: plasmide DNA
- Pellet: gDNA
2. ISOLATIE VAN RNA
Principe
Openbreken van cellen en weefsels
Lysis van de celmembraan, maar hier met een mild detergent (NP40)
RNA scheiden van de rest van de celinhoud
Verdere opzuivering
- Zure fenol-chloroform extractie
o Denaturatie van eiwitten met guanidine thiocyanaat
o Faseverdeling in fenol/CHCl3 → centrifugatie
2
,Opgelet: RNase-vrij werken!! RNase wordt niet geïnactiveerd door autoclaveren. We kunnen RNase
afbreken adhv DEPC. DEPC reageert met het katalytisch histidine in het reactief centrum van RNase =
inhibitie van een enzymatische activiteit. DEPC voor alle waterige oplossingen RNase vrij te maken +
nadien autoclaveren. RNA steeds op ijs houden en steeds werken met handschoenen!
- Ethanolprecipitatie en kolomchromatografie (zie DNA).
Extra
- Toevoegen RNase inhibitoren: RNAlater, RNAsin
- Denaturatie RNasen: guanidine isothiocyanaat
- Elutie in steriel RNAse-vrij water
Total RNA-extract: 95% rRNA, 5% mRNA. Verrijking door mRNA = om hogere concentraties aan
mRNA te bekomen:
- Kolom met silicamatrix: enkel lange mRNA-ketens worden gebonden (>200NT)
- Kolom met affiniteit: oligo (dT)cellulose of poly(U)sepharose: bead met verschillende T NT →
poly-A staart zal hieraan binden.
Bewaring
Bij -20°C of -80°C.
Concentratiebepaling
Absorbantie bij 260nm: C = A260 . 40
Zuiverheid
A260/A280 = 1,7-2,0 en A260/A230 > 1,5
Kwaliteit
Afbraak van RNA? Agarose gel
- Scherpe 18S en 28S ribosomale banden = intact RNA
- Smeer van afgebroken 18S en 28S rRNA = afgebroken RNA
Afbraak van RNA? Bioanalyzer
- Scherpe ribosomale pieken: 18S < 28S = intact RNA
- RIN (RNA integrity number)
o RIN = 10 → intact
o RIN < 10 → afgebroken RNA
3. STABILITEIT DNA VS RNA?
DNA is het meest stabiel omdat het ds is en het heeft geen OH. OH
zorgt voor onstabiliteit.
3
, ENZYMEN DIE INWERKEN OP DNA OF RNA
DNASE I
Dit is een endonuclease die DNA hydrolyseert tot oligonucleotiden. Het
verknipt de verbinding tussen de fosfaatgroep. Toepassing: aantonen van
DNA-bindende eiwitten die DNA beschermen tegen afbraak. DNase I
situeert die EW. Als EW gebonden zijn op die ene plaats dan kan DNase I
daar niet knippen. Footprint te zien:
RNASE
Dit is een endonuclease die RNA hydrolyseert tot oligonucleotiden.
- RNase A = splitst ssRNA aan 3’-C of 3’-U → 3’-fosfaat uiteinde
- RNase H = splitst ssRNA in DNA/RNA-duplex → 5’-fosfaatuiteinde
o Bij aanmaak cDNA
- RNase III = splitst ds 16S en 23S rRNA in operon. Het splitst ook ds pri-miRNA tot matuur
miRNA (DROSHA en DICER)
DNA-POLYMERASE
Komt tepas tijdens PCR en replicatie. Template is ssDNA. Dan pas kan DNA polymerase binden en zijn
werking uitvoeren.
DNA-polymerase I:
- 5’-3’ polymerase-activiteit (extension)
- 5’-3’ exonuclease-activiteit = NT verwijderen
- 3’-5’ exonuclease-activiteit (proofreading = bij een verkeerd ingebouwde NT kan deze nog
verwijdert worden en vervangen worden door een goed NT)
Klenow-fragment:
- Geen 5’-3’ exonuclease-activiteit
- Toepassing: cDNA synthese en DNA sequencing
Thermostabiele polymerase: actief bij 37°C
- Taq DNA-polymerase: geen 3’-5’ exonuclease activiteit → geen proofreading →
replicatiefouten (1/100bp)
- Pfu en Pwo DNA-polymerase: sterk 3’-5’ exonuclease, minder 5’-3’ polymerase → minder
replicatiefouten (1/106)
- Toepassing: Pfu en Pwo in combinatie met Taq voor amplificatie van lange DNA fragmenten
RNA-POLYMERASE
Voor de transcriptie. Template moet ssDNA zijn met promotor.
Indien geen promotor aanwezig, dan kan RNA polymerase niet
werken. Vaak zijn de promotors afkomstig van virussen.
4
