BMW Genoom Deel 2 - HC Samenvatting DNA Analysetechnieken

Biomedische Wetenschappen
Blok 2 Genoom – Deel 2
Inhoud
DNA-Analyse.......................................................................................................................................3
DNA-manipulatie technieken – recombinant technieken.......................................................................7
BMW Genoom – HC 2 – maandag 18 januari.......................................................................................11
CRISPR/Cas9 gene editing.................................................................................................................11
BMW Genoom – Next Generation Sequencing – maandag 25 januari.................................................19
Specifieke toepassingen van DNA-analyse m.b.v NGS......................................................................23
BMW Genoom – HC Onderzoeksvragen en designs – Ma 25 jan..........................................................27




1

,BMW Genoom – HC 1 – maandag 11 januari
In vivo = in een levende omgeving / cel
In vitro = in een reageerbuis
Manieren om cellen en celprocessen te manipuleren
 DNA veranderen of toevoegen
 RNA toevoegen (mRNA / siRNA)
 Eiwit toevoegen
 Kleine moleculen toevoegen
Verschillende analyse technieken
 DNA
1. PCR - aanwezigheid
2. Restrictie-enzymen -
aanwezigheid
3. DNA-gelelectroforese -
aanwezigheid
4. Sanger sequencing (dideoxy-
sequencing) - sequentie
5. Next Generation sequencing -
sequentie
 RNA
1. In-situ hybridisatie –
aanwezigheid en locatie
2. cDNA maken- aanwezigheid en
sequentie
3. RT-PCR - hoeveelheid
4. RNA sequencing – hoeveelheid,
aanwezigheid en sequentie
Hybridisatie = het aan elkaar zitten van
DNA en RNA door de basenparen. Het is een
basisprincipe in veel DNA- en RNA-technieken. Vaak is het een klein
complementair stukje dat op een lange streng gaat hybridiseren. Komt door
Brownian motion
1. Denaturatie
2. Renaturatie
3. Primer (PCR), probe of oligo (NGS)




2

, DNA-Analyse
[1] PCR – Polymerase Chain Reaction
 Als doel: selecteren + ampliferen
 Voorwaarden: de uiteinden van het stuk dat je wilt vermeerderen zijn
bekend
 Het stuk dat je wilt vermeerderen kan max. enkele duizenden bp groot zijn
 Er wordt gebruik gemaakt van de temperatuur.
Hoge T  H-bruggen van DNA gaan uit elkaar waardoor het kan dienen als
template.
Lage T  H-bruggen herstellen weer waardoor basenparing plaatsvindt
 DNA polymerase gaat door, waardoor je ook nog extra DNA krijgt die je
niet wilt
 Na een aantal cycli heb je pas de stukjes DNA die je écht wilt gebruiken.
De andere stukjes zijn aanwezig in een verwaarloosbaar lage concentratie
1. Je hebt DNA (in vitro)
2. Toevoegen een stukje DNA aan het eind + een stukje DNA aan het begin –
2 primers. Op twee plekken heb je een startpunt voor de DNA polymerase
(3’OH kant)
3. Toevoegen Taq DNA polymerase en nucleotiden
4. Transcriptie van het gen
[2] Restrictie-enzymen - endonucleases
 Enzymen die een sequentie in het
dsDNA herkennen en hierin knippen
(hydrolyse-reactie)
 De herkenning is van een
symmetrische sequentie (GAAGTC /
CTGAAG)
 Binden vaak als dimeer
 Sticky ends = basen die een
overhang hebben met elkaar
 Blunt end = als er rechtstreeks wordt geknipt (Haelll)
[3] DNA-gelelectroforese
 Gelatine achtige vloeistof fungeert als zeef waar stukjes DNA
doorheen moeten
 Er wordt spanning toegevoegd zodat het DNA (-) gaat bewegen
naar de (+) pool
 Scheiding DNA fragmenten op basis van grootte waarbij de
kleine DNA stukjes sneller over de vloeistof vloeien en dichter
bij de + pool komen
 1 DNA molecuul kan je NIET zien, je hebt meerdere DNA
fragmenten van dezelfde grootte nodig voor een streepje
 DNA-fragmenten zichtbaar gemaakt door ethidiumbromide en
UV-licht of fluorescente vloeistof (giftige stof)
[1,2,3] DNA-restrictie-enzym analyse – Digestie
 Je kan ook zien of iemand dan heterozygoot of homozygoot is
1. PCR een stukje van het waarin één nucleotidevariatie zit

3