Samenvatting cel 2 - cytologie - H1,2,3,6

Hoofdstuk 1 – prepareren en observeren van cellen en weefsels
 Doel: cellen en weefsels observeerbaar maken voor LM (= lichtmicroscoop) of EM
(= elektronen microscoop)
 Probleem = dik materiaal: weinig licht (elektronen) doorlatend, weinig contrast in biologisch
materiaal.
 Methodes:
o Fixeren
o Inbedden en snijden
o Kleuren of contrasteren

1.1. Prepareren en observeren van cellen
 Monoloogcultures = 1 laag van cellen dat men kon laten groeien in een op male
omgeving/medium (EMEM) (proberen lichaam na te bootsen)
 Stabiele cellijnen maken  niet nodig om telkens nieuw stukje huid te nemen en dat in
cultuur brengen. Nu proberen om cellen in een stabiele cultuur te behouden.
o Je behandelt het weefsel enzyma sch met een collagenase oplossing.
o Hierdoor zakken de cellen uit of worden ze naar de bodem gecentrifugeerd
o Cellen worden uitgeplaat in een groeirecipient (hier in een petridish). Dit is de
primaire cultuur (systeem waarmee je start)
o Hopelijk overleven er cellen en zijn ze in staat om te groeien.
o Indien er cellen zijn gegroeid en je een confluente laag van cellen hebt, moet je de
cellen losmaken en splitsen en naar een secundaire cultuur brengen.
 Monolaagcultuur van epitheelcellen = 1 laag cellen
 Kolonies ontstaan uit 1 enkele cel en bestaat uit meerdere hoopjes cellen
 Cultuurcondi es/medium:
o MEM bevat:
 Isotonische zouten: lichaamcultuur nabootsen
 Energiebron: cellen moeten groeien
 Essen ële AZ en vitamines: de AZ en vitamines die de cellen niet zelf kunnen
maken.
 Serum
o Culturen moeten groeien onder juiste condi es: atmosfeer van 5% CO2 en met een
goede pH (7.4)
o Voor ons onderzoek moeten we ervoor zorgen dat onze cellen die groeien in vitro
vergelijkbaar zijn met de cellen in het lichaam (in vivo)
 We moeten ook werken met de juiste media: gesloten flessen, open platen, rollerflessen in
warme kamer, CO2-oven
 Proberen om zo goed mogelijk het menselijk lichaam na te bootsen (zelfde
omgeving/cultuur) zodat de cellen in vitro vergelijkbaat zijn met de cellen in vivo.
 Oorsprong van cellen, cellijnen:
o Uit celbank materiaal aankopen.
 Groeisubstraten en -procedures
o In vitro nabootsen van in vivo

, o Cellen groeien op een vaste ondergrond (substraat = fysische drager) maar
beschermt ook tegen anoïkis (= vorm van geprogrammeerde celdood of apoptose).
o Essen eel voor adherente celculturen  cellen die moeten groeien op een vaste
ondergrond.
o Bloedcellen zi en los in het lichaam en binden dus niet aan substraat, dus deze
moeten ook los in het medium zi en.
 In vivo hebben cellen contact met hun micro-omgeving:
o Contact is o.a. fysisch tussen cellen of tussen cellen en de basale membraan (contact
met de extracellulaire matrix)
o Ook contact via secre e van bv. groeifactoren
 Cellen in cultuur delen tot ze een confluente 2D-monolaag vormen, wanneer ze een volledige
monolaag hebben gevormd volgt er contac nhibi e van celprolifera e
o Je moet je culturen gaan splitsen en naar een dochtercultuur brengen
o Splitsen gebeurt via trypsine-EDTA procedure
o Trypsine-EDTA:
 Trypsine = maagprotease: gaat oppervlakte eiwi en van de cellen a reken
(soort van schaar: knipt de cellen van het substraat en van elkaar)
 EDTA = cheleert calcium en magnesium (zorgt ervoor dat er contacten zijn
voor de eiwi en)
 Tumorcellen kunnen ook in 3D groeien:
o Tumorcellen kunnen het vermogen van contac nhibi e hebben verloren waardoor ze
in groepjes/hoopjes kunnen groeien.
 Stappen bij celadhesie en -spreiding na het plaatsvinden en uitplaten van de cellen:
o De cellen zakken uit onder invloed van gravita e
o Ze maken ini eel contact met het substraat (minimale oppervlakte van adhesie
waardoor de cellen nog opgebold zijn)
o In de eerstvolgende uren ondergaan ze een proces van progressieve spreiding over
het substraat
 Dit vraagt energie en cytoskelet-wijziging wat leidt tot vergro ng van
celcontact-oppervlakte en versterking van cel-substraatadhesie.
o Tenslo e gaan ze een sterke binding aan met het substraat
 Cel kan traag migreren over het celoppervlakte: hierbij wordt focaal een jdelijke celadhesie
geïnhibeerd (waardoor de cel loskomt) en elders de celadhesie opgebouwd (in de rich ng van
de celmigra e)
 Cellen kan je gaan differen ëren:
o Vb. myoblasten (voorloper van de spiercellen)  myotube
 Stamcellen:
o = een cel die het vermogen hee om zich voortdurend te delen en te differen ëren
(ontwikkelen) in verschillende andere soorten cellen/weefsels.
o Stamcellen hebben twee belangrijke eigenschappen:
 Het vermogen tot zelfvernieuwing, waarbij ze zichzelf delen en kopieën van
zichzelf maken.
 Het vermogen om te differen ëren, waardoor de volwassen celtype ontstaan
die onze organen en weefsels vormen
o To potente stamcellen:

,  In de eerste uren na de bevruch ng deelt de bevruchte eicel zich in twee
cellen. Een van deze cellen of beide hebben poten e om zich tot een foetus
te ontwikkelen. Een stamcel is ‘to potent’ als deze de poten e hee om zich
tot een volledige foetus te ontwikkelen.
o De bevruchte eicel deelt zich eerst en elke cel gaat door met celdeling. Wanneer er
ongeveer 140 to potente stamcellen zijn, vormen ze de blastocyst. De cellen innen
de blastocyst, worden de binnenste celmassa genoemd. Als de blastocyst zich in de
baarmoeder nestelt, differen ëren de buitenste cellen van de blastocyst in de cellen
die verantwoordelijk zijn voor de vorming van de placenta. De binnenste celmassa
wordt de foetus. De binnenste celmassa kan zich niet ontwikkelen tot een foetus als
er geen placenta is, daarom zijn deze cellen niet meer potent maar pluripotent. Dat
wil zeggen dat ze de poten e hebben om zichzelf te ontwikkelen tot veel, maar niet
alle verschillende celtypen.
o Mul potente stamcellen:
 De individuele cellen binnen de binnenste celmassa worden geleidelijk aan
meer gespecialiseerd. Hemopoë sche stamcellen zijn mul potent, dat wil
zeggen dat ze zich kunnen ontwikkelen tot verschillende soorten meer
gespecialiseerde cellen zoals rode bloedcellen, bloedplaatjes en wi e
bloedcellen, maar ze zijn beperkt tot de ontwikkeling van bloedcellen.
 Embryonale stamcellen:
o Experiment muis:
 Embryonale stamcellen isoleren uit de muis.
 Binnenste celmassa geïsoleerd uit muisembryo
 Binnenste celmassa wordt in een dubbele cultuur gelegd omdat de
stamcellen veel informa e en componenten nodig hebben:
 Eerst een laag met fibroblasten uit jong muis embryo. Die
produceren veel verschillende eiwi en dat in het medium komt. Die
eiwi en zijn nodig om onze stamcellen in een goede cultuur te
behouden.
 Tweede laag = de binnenste celmassa
 Uit de embryonale stamcellen kunnen we volledige nieuwe muis maken want
we werken met de pluripotente stamcellen.
o Aanmaak Humane embryonale stamcellen:
 Zelfde proces als ‘experiment muis’: proberen cellen uit de morula te halen
(pluripotente stamcellen) en deze in vitro bewaren met nagemaakt
mensencultuur.
 Lukt niet om een volledig embryo te maken maar we kunnen wel
verschillende soorten organen maken.
 Ethische twijfel of dat het wel ethisch is om met pluripotente stamcellen te
werken uit een menselijk embryo.
o Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs):
 Proces van experiment is minder ethisch beladen.
 Huidcel van de mens isoleren en in cultuur brengen en deze met een
bepaalde mix van eiwi en gaan mengen waardoor er pluripotente
stamcellen uit ontstaan.

,  Bedoeling om nieuw stukje huid te maken vanuit de pa ënt zijn eigen cellen.
o Goeie kwaliteitscontrole:
 We willen werken met cellen en niet met bacteriën of schimmels of met
mycoplasma.
 Mycoplasma = zorgt ervoor dat onze cultuur helemaal verandert.
Waardoor celvorming in vitro niet meer vergelijkbaar is met de cellen
in het menselijk lichaam.
 Zorgen dat er geen contamina e is met vreemde cellen:
 HeLa-cellijn = een klassieke cellijn afgeleid van een humane cervix-
tumor. Deze cellijn wordt overal gebruikt.
 Cellijn verspreidt zich naar andere celculturen door vuile pipe en
waar de cellen mee in transporteren.
 Als je werkt met cultuur X, wil je daar zo lang mogelijk mee werken
en wil je niet dat er een andere cellijn zoals HeLa-cellijn in gegroeid
wordt.
 Zorg dat je heel steriel werkt.
 Zorgen dat de cellen normaal blijven
 Regelma g controleren of dat je wel nog met de lijn werkt waarin je
wilt werken.

1.2. Prepareren en observeren van weefsels.
 Snijden = gebruik van microtoom:
o Klein stukje weefsel fixeren:
 Oorspronkelijke situa e stabiliseren/behouden van oorspronkelijke structuur
door denatura e van eiwi en.
 Als weefselstukje uit zijn normale in vivo situa e wordt
weggenomen, worden a raakenzymen ac ef wat leidt tot
degrada e van het weefsel
 Om deze a raakprocessen tegen te gaan, moet de ac viteit van de
enzymen/eiwi en worden s lgelegd. = denatura e van eiwi en
 Denatura e van eiwi en kan gebeuren door het bevriezen van het weefsel of
door gebruik te maken van chemische fixa emiddelen.
 Formol (LM)
 Glutaraldehyde (EM)
 Artefacten = veranderingen die jdens de fixa e in een weefsel ontstaan en
afwijken van de in vivo situa e.
 Dit kan een structuurverandering zijn of het op een andere plaats
voorkomen van componenten
o Dehydrateren
o Vloeibare paraffine (dehydrata e is nodig omdat paraffine hydrofoob is en dus niet
combineerbaar is met water)
o Sec es (0.5μm - 50μm) snijden met een microtoom
o Sec es op een microscoop glaasje kleuren
 Hematoxiline/Eosine-kleuring

,  Inbedden:
o Het gefixeerde materiaal moet met een substan e voldoende hard gemaakt worden
om coupes te krijgen waar of lichtstralen of elektronen door kunnen.
o Inbedmiddelen = meestal hydrofoob.
 Substan es die in het weefsel indringt
 Substan es die hard wordt
 Materiaal wordt snijdbaar
o Om goede coupes te krijgen moet het inbedmiddel het weefsel volledig kunnen
binnendringen. Anders zal het slecht snijdbaar zijn.
o LM = paraffine
o EM = hars of plas cs
 Snijden:
o Paraffine = 5-10μm (doorlaatbaar voor licht)
o Hars, plas cs = 70 nm (doorlaatbaar voor elektronen)

1.3. De ontwikkeling van de lichtmicroscoop
 Lichtmicroscoop:
o Resolu e van 200 nm: bepaald door objec ef en door de golflengte van het zichtbaar
licht
o Celcultures op bv dekglaasjes worden behandeld in toto
o Dikker materiaal zoals weefsels worden versneden in coupes.
o Effec eve resolu e wordt mede bepaald door natuur van preparaat
 H/E-kleuring, fixa e,…
 Het klassieke licht- of klaarveldmicroscoop:
o Lichtbron met wit licht. Licht wordt naar ons preparaat gestuurd.
o Licht wordt netjes op ons preparaat gebracht door 1ste lens: de condensor.
o Objec ef gaat ervoor zorgen dat de 1ste vergro ng plaatsvindt = 2de lens.
 = zeer belangrijk: bepaalt hoe goed je lenssysteem is.
 Ook belangrijk wat er tussen je cellen weefsel zit: kan lucht zijn, druppel
water of olie,…
o Oculair lens = 3de lens. Zorgt ook voor een vergro ng
o Na oculair lens heb je het oog = 4de lens.
 Welke vergro ng ga je bereiken met je lens:
o Oculaire lens zit vast, kan je dus niet veranderen: 10x-lens
o Objec even zi en op revolver, kan je draaien en dus ook je lens veranderen.
 Verschillende lenzen: 10x, 40x, 100x
 Totale vergro ng = 10x (oculair) * 10x (objec ef) = 100x
 Gebruik van de klassieke lichtmicroscoop om naar gekleurd materiaal (H/E-gekleurd) te kijken
 Soorten lichtmicroscopen,:
o Histologie-microscoop = de standaard LM
o Discussie-microscoop = LM waarbij meerdere oculaire lenzen waardoor verschillende
mensen door kunnen kijken waardoor men hetzelfde bekijkt
o Geïnverteerde LM = afstand tussen hetgeen dat je wilt bekijken en de objec ef is
groter dan bij de standaard LM waardoor je gehele celculturen in een schaaltje kunt
bekijken.

,  Kleuring:
o Hematoxyline kleurt de kernen paars/donker paars.

 Speciale LM voor levende cellen:
o Ongekleurde preparaten hebben doorgaans geen contrast en geven in een
klaarveldmicroscoop geen bruikbaar beeld.
o De fasecontrast-LM berust op het bewerken van kleine faseveranderingen die
ontstaan door kleine brekingsverschillen in het preparaat, zodat deze zich voordoen
als amplitudeverandering (licht/donker). Fasecontrast wordt toegepast op
ongekleurde preparaten, zoals gekweekte levende cellen, of vriescoupes van
ongefixeerde en ongekleurde weefsel.
o Differen eel interferen e -contrastmicroscopie: verschillen in interferen e van
doorvallend gepolariseerd licht. Vereist een gespecialiseerde microscoop met
prisma’s en interferen efilters.
 Fasecontrastmicroscopie:
o Klaarveldmicroscoop = kijken naar gekleurd materiaal. Door de kleuring krijg je een
verstoring waardoor je de kleur kunt zien.
o Vaak kijken we naar ongekleurde cellen/weefsel, waardoor licht wel door membraan,
kern of andere organellen kan. Kleine brekingsindex aanwezig door de kleine
verschillende varia es die er binnen een cel afspelen.
o Met een fasecontrastmicroscoop vergroot je de faseverschuivingen in het opvallend
licht. Dit wordt door interferen e (+ of -) herleid tot zwart-wit beeld in de
fasecontrastmicroscopie
o Verschil duidelijker maken met fasecontrast-ringen.
 Fluorescen emicroscopie:
o Niet met neerslag gaan werken (bruin of blauw) maar met fluorochromen
(= materiaal dat fluoresceert).
o Epifluorescen e, waarbij geac veerd wordt met excita elicht van korte golflengte
(ultraviolet-blauw, groen), en de fluorochrome stof in het preparaat vervolgens
emissielicht uitzendt van langere golflengte (groen, rood-infrarood licht).
o Gebruik van excita efilters om bepaalde kleur als licht te gebruiken.
o Verschillende mixen gebruiken:
 Ion-gevoelige kleurstoffen: de fluorescen e van de gebruikt kleurstof hangt
af van de concentra e ionen.
Intracellulaire calcium kan verhogen door bepaalde s muli dit kan vervolgens
leiden tot een cellulaire respons. Fura-2 = calcium gevoelige kleurstof
 Immunofluorescen e microscopie: specifieke eiwi en detecteren m.b.v.
an lichamen waaraan een fluorochroom is geconjugeerd.
 Primaire en secundaire (fluorochroom is hieraan gekoppeld)
an lichamen koppelen.
 Tagging van eiwi en met fluorescente eiwi en, hierdoor kunnen specifieke
eiwi en in levende cellen worden gedetecteerd.
 DNA dat codeert voor bepaald eiwit kunnen we langer maken. 
fusie-eiwit.