Principles and techniques of biochemistry and molecular biology edited by
Andreas Hofmann and Samuel Clokie
Les 2
Achtergrond van immunologie. Belangrijk om te weten is dat 1 b-cel 1 antilichaam maakt. Na
een binding tussen een antilichaam en een antigen ontstaat er clonale expantie. Dit is de
vermeerdering van de antilichamen door hoge productie door de b-cellen.
IgG monomeren zijn Y-gevormd. Ze hebben 2 antigen bindingsplekken aan de bovenkant,
80% van de totale antilichamen in het serum zijn IgG monomeren. Het zorgt voor
neutralisatie van allerlei stoffen welke niet in het lichaam thuishoren, onder neutralisatie valt
binding of opsonisatie. Deze antilichamen worden het meest gebruik voor onderzoek.
B-cel activatie tijdens een COVID-19 infectie: verschillende antilichamen typen
IgG1 en IgG2 komen het meeste voor en worden hierom ook het meeste gebruikt tijdens
onderzoek.
Epitopen op een antigen zijn de bindingsplekken waar antilichamen kunnen binden.
Antigenen zijn gepresenteerd door APCs, dit zijn meestal dendritische cellen.
Antilichamen worden vaak immuunglobuline genoemd. De zware onderste keten worden de
Fc redio genoemd, dit is de constante regio. De bindingsplekken zitten aan de bovenkant van
het antilichaam, dit is de Fab regio en variabel. Hier spreek je van een lichte keten.
Antigenen
Antilichamen herkennen de epitopen van antigenen.
Polyclonale antilichamen zijn antilichamen welke van verschillende b-cellen komen en
hierdoor dus ook meerdere epitopen kunnen herkennen. Het voordel hiervan is dat ze robuster
zijn, hogere sensitiviteit hebben en meer tolerant tegen veranderingen zijn. Het nadeel is dat
1
,er meer achtergrond is, dit is dat er meerdere bindingen gaan ontstaat welke niet gevraagd
worden.
Monoclonale antilichamen zijn antilichamen welke afkomstig zijn van 1 b-cel door clonale
expantie. Ze zijn afkomstig van hybridoma, dit is een kanker cellijn welke is gefuseerd met
een b-cel. Ze zijn heel specifiek, hebben minder achtergrond, minder cross-reageren en geen
of lagere batch-to-batch variabiliteit. Het nadeel hiervan is dat ze minder sensitiviteit zijn en
duur.
Antilichaam binding is erg specifiek en wordt in verschillende methodes gebruikt:
- Immunohistochemistry (weefsel)
- Imunmunocytochemistry (cellen)
- Western blot
- Co-immunoprecipitatie (CoIP)
- Flow cytometrie FACS
- ELISA
Een indirecte ELISA is het vaakst gebruikt en is erg specifiek, hierbij worden 2 antilichamen
gebruikt.
Competitive ELISA: antigen-antibody competition
- In deze techniek, het antilichaam is eerste geincubeert in de oplossing met een sample
met anitgen
- De antigen-antilichaam mix wordt dan toegevoegd in een antigen gecoate micrtiter
plaat
- Hoe meer antigen er gepresenteerd wordt in de uiteindelijke oplossing sample, hoe
minder vrije antilichamen er beschikbaar zijn voor een binding van de antigen gecoate
well
- In het competitieve assay, hoe hoger de concentratie van antigenen in de originele
sample, de lager het signaal.
Hoe meer antigen er gebonden is aan het antilichaam voor het de plaat in gaat hoe lager het
signaal. De overige antigenen binden aan het antilichaam in de plaat, dit verschil kun je
vervolgens met elkaar vergelijken.
2
, Les 3
H4 chromatografie & H7 vloeistofchromatografie (tm 7.8)
Chromatografie is een scheidingsmethode op basis van verdeling. De mobiele fase bepaald de
naamgeving van de chromatografie. Wat niet op de LC gemeten kan worden meten we op de
GC. Alcohol meten we bv op de GC maar kan wel op de LC.
Scheidingsprincipe van chromatografie, kan LC en GC zijn. De eerste kolom is t0, dit is de
tijd van injectie. De analieten zijn in kolom 1 niet gescheiden. Er worden geen bindingen
gevormd maar interacties (vdWaals krachten etc).
Tb staat voor de retentie tijd van het eluens van B, dit is de tijd dat nodig is voor de analiet om
door de kolom te komen. De flow van de mobiele fase zorgt voor de retentie tijd. Deze flow
drukt de analieten door de kolom heen.
Het volume Vr (ml) = retentietijd (min) x Flow (ml/min)
Tm is de dode tijd, dit is de tijd dat de componenten in de mobiele fase zit, deze tijd hebben
ze nodig om door de kolom te komen. Sneller kan een component niet door de kolom.
Hiermee kun je bepalen hoelang een component in de stationaire fase zit
Retentie tijd – Tm = Netto retentietijd (daadwerkelijke interactie)
3
Andreas Hofmann and Samuel Clokie
Les 2
Achtergrond van immunologie. Belangrijk om te weten is dat 1 b-cel 1 antilichaam maakt. Na
een binding tussen een antilichaam en een antigen ontstaat er clonale expantie. Dit is de
vermeerdering van de antilichamen door hoge productie door de b-cellen.
IgG monomeren zijn Y-gevormd. Ze hebben 2 antigen bindingsplekken aan de bovenkant,
80% van de totale antilichamen in het serum zijn IgG monomeren. Het zorgt voor
neutralisatie van allerlei stoffen welke niet in het lichaam thuishoren, onder neutralisatie valt
binding of opsonisatie. Deze antilichamen worden het meest gebruik voor onderzoek.
B-cel activatie tijdens een COVID-19 infectie: verschillende antilichamen typen
IgG1 en IgG2 komen het meeste voor en worden hierom ook het meeste gebruikt tijdens
onderzoek.
Epitopen op een antigen zijn de bindingsplekken waar antilichamen kunnen binden.
Antigenen zijn gepresenteerd door APCs, dit zijn meestal dendritische cellen.
Antilichamen worden vaak immuunglobuline genoemd. De zware onderste keten worden de
Fc redio genoemd, dit is de constante regio. De bindingsplekken zitten aan de bovenkant van
het antilichaam, dit is de Fab regio en variabel. Hier spreek je van een lichte keten.
Antigenen
Antilichamen herkennen de epitopen van antigenen.
Polyclonale antilichamen zijn antilichamen welke van verschillende b-cellen komen en
hierdoor dus ook meerdere epitopen kunnen herkennen. Het voordel hiervan is dat ze robuster
zijn, hogere sensitiviteit hebben en meer tolerant tegen veranderingen zijn. Het nadeel is dat
1
,er meer achtergrond is, dit is dat er meerdere bindingen gaan ontstaat welke niet gevraagd
worden.
Monoclonale antilichamen zijn antilichamen welke afkomstig zijn van 1 b-cel door clonale
expantie. Ze zijn afkomstig van hybridoma, dit is een kanker cellijn welke is gefuseerd met
een b-cel. Ze zijn heel specifiek, hebben minder achtergrond, minder cross-reageren en geen
of lagere batch-to-batch variabiliteit. Het nadeel hiervan is dat ze minder sensitiviteit zijn en
duur.
Antilichaam binding is erg specifiek en wordt in verschillende methodes gebruikt:
- Immunohistochemistry (weefsel)
- Imunmunocytochemistry (cellen)
- Western blot
- Co-immunoprecipitatie (CoIP)
- Flow cytometrie FACS
- ELISA
Een indirecte ELISA is het vaakst gebruikt en is erg specifiek, hierbij worden 2 antilichamen
gebruikt.
Competitive ELISA: antigen-antibody competition
- In deze techniek, het antilichaam is eerste geincubeert in de oplossing met een sample
met anitgen
- De antigen-antilichaam mix wordt dan toegevoegd in een antigen gecoate micrtiter
plaat
- Hoe meer antigen er gepresenteerd wordt in de uiteindelijke oplossing sample, hoe
minder vrije antilichamen er beschikbaar zijn voor een binding van de antigen gecoate
well
- In het competitieve assay, hoe hoger de concentratie van antigenen in de originele
sample, de lager het signaal.
Hoe meer antigen er gebonden is aan het antilichaam voor het de plaat in gaat hoe lager het
signaal. De overige antigenen binden aan het antilichaam in de plaat, dit verschil kun je
vervolgens met elkaar vergelijken.
2
, Les 3
H4 chromatografie & H7 vloeistofchromatografie (tm 7.8)
Chromatografie is een scheidingsmethode op basis van verdeling. De mobiele fase bepaald de
naamgeving van de chromatografie. Wat niet op de LC gemeten kan worden meten we op de
GC. Alcohol meten we bv op de GC maar kan wel op de LC.
Scheidingsprincipe van chromatografie, kan LC en GC zijn. De eerste kolom is t0, dit is de
tijd van injectie. De analieten zijn in kolom 1 niet gescheiden. Er worden geen bindingen
gevormd maar interacties (vdWaals krachten etc).
Tb staat voor de retentie tijd van het eluens van B, dit is de tijd dat nodig is voor de analiet om
door de kolom te komen. De flow van de mobiele fase zorgt voor de retentie tijd. Deze flow
drukt de analieten door de kolom heen.
Het volume Vr (ml) = retentietijd (min) x Flow (ml/min)
Tm is de dode tijd, dit is de tijd dat de componenten in de mobiele fase zit, deze tijd hebben
ze nodig om door de kolom te komen. Sneller kan een component niet door de kolom.
Hiermee kun je bepalen hoelang een component in de stationaire fase zit
Retentie tijd – Tm = Netto retentietijd (daadwerkelijke interactie)
3
