Samenvattingen
1. Waarnemingsmethoden
Prepareren van cellen en weefsels voor microscopie
Fixeren dient om het metabolisme te stoppen, de structuur vast te leggen en het weefsel klaar te maken
voor verdere bewerking, zoals coupes maken en kleuren.
Chemische fixatie denatureert eiwitten onder andere door ‘crosslinking’ waarbij enzymen onwerkzaam
worden, maar autolyse voorkomen wordt.
Chemisch fixeren gebeurt door het toepassen van formaldehyde, glutaaraldehyde of osmiumtetroxide,
al dan niet na elkaar of in combinatie.
Fysisch fixeren kan door bevriezen.
Na dehydratie in een alcoholreeks met opklimmende sterkte en impregnatie met paraffine of
monomeer plastic worden kleine weefselstukjes en cellen ingebed.
Paraffinecoupes worden op een microtoom gesneden tot coupes van 5 µm voor LM. Ultradunne coupes
van 50 nm voor TEM worden gesneden op een ultramicrotoom.
Voor SEM geldt een aangepaste procedure.
Coupes worden op een preparaatdrager gebracht (microscoopglaasje of gridje) en gekleurd of
gecontrasteerd met verschillende middelen.
Voor LM is HE-kleuring (hematoxyline / eosine = basische/zure kleurstof) de gangbare kleuring. Voor
TEM worden oplossingen van zware metalen zoals lood- en uranylionen gebruikt.
DNA en RNA kleuren met hematoxyline donkerblauw en worden basofiel genoemd. Eiwitten kleuren
lichtroze met eosine en worden acidofiel of eosinofiel genoemd.
Lichtmicroscopie
Helderveld microscopie maakt gebruik van normaal, wit licht. De aangekleurde celonderdelen in de
coupe komen met deze methode naar voren. Varianten zijn donkerveld- of polarisatie-microscopie .
Fluorescentiemicroscopie gebruikt ultraviolet licht (met kleine golflengte) om fluorescerende moleculen
in een coupe op te sporen op grond van hun emissie van licht met een langere golflengte. Hiermee
kunnen natuurlijke of aangebrachte moleculen en specifieke probes worden opgespoord.
Fasecontrastmicroscopie is gebaseerd op de natuurlijke verschillen in de brekingsindex van cellen en
weefsels. Kleuring is niet nodig, zodat levende cellen in een uitstrijkje of celkweek direct waargenomen
kunnen worden.
Interferentiemicroscopie is vergelijkbaar met fasecontrastmicroscopie, maar vormt een reliëfbeeld.
Confocale microscopie scant een preparaat met een monochrome laserbundel die in een vlak in het
preparaat gefocusseerd wordt. Bij de beeldvorming wordt het fluorescentielicht buiten dit vlak
weggefilterd. Beelden uit opeenvolgende vlakken kunnen door een computer tot een fluorescent 3D-
beeld worden samengesteld.
1
, Samenvattingen
De resolutie van de lichtmicroscopie benadert 0,25 µm. Met behulp van speciale
computerondersteunde technieken kan men nu onder deze grens komen met de superresolutie-
microscoop.
De ‘ atomic-force’-microscoop (AFM) is gebaseerd op een aftastende siliconen sensor, maar in het
onderzoek is deze microscoop nog niet echt doorgebroken.
Elektronenmicroscopie
Als beeldvormend medium hebben elektronen een veel kleinere golflengte, zodat een transmissie-
elektronenmicroscoop (TEM) een hogere resolutie geeft, tot 0,1 nm. Daarmee kan men de
ultrastructuur van cellen en weefsels tot op moleculair niveau bestuderen.
In een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) vormen de elektromagnetische lenzen een
elektronenbundel. Als deze bundel een ultradun preparaat doorstraalt, ontstaat een beeld doordat
zware metalen van de contrastering elektronen uit de bundel ‘wegkaatsen’. Het beeld wordt
weergegeven via een fluorescentiescherm of een camera.
Vriezen en breken van bevroren cellen of weefsels maakt de studie van het gedetailleerde oppervlak
mogelijk. Het oppervlaktereliëf kan nog versterkt worden door vriesetsen, eventueel gevolgd door het
maken van een replica met het opdampen van zware metalen op het oppervlak in een vacuüm.
‘Scanning’-elektronenmicroscopen (SEM) scannen het oppervlak van een preparaat met een
elektronenbundel. Deze weekt uit het preparaat secundaire elektronen los, die vervolgens door een
detector geregistreerd worden. Het preparaat bevindt zich in een vacuüm en is met een dun laagje goud
bedekt om het geleidend te maken.
Cel- en weefselkweek
Door hun relatieve onafhankelijkheid kunnen cellen, nadat ze uit hun weefselverband los zijn gemaakt,
in vitro gekweekt worden in een samengesteld medium. Sommige cellijnen kunnen geruime tijd verder
worden gekweekt. Primaire culturen van vers geïsoleerde cellen worden meestal gedurende een
beperkte tijd gebruikt. Celkweken in een petrischaal worden meestal van onderen bekeken met een
‘invert’-microscoop.
Cyto- en histochemie
Enzymcytochemie maakt gebruik van de restactiviteit van een enzym na ‘zachte’ fixatie. Het
aangeboden substraat wordt omgezet door het enzym, terwijl in het medium een reagens aanwezig is
dat het product van het enzym zichtbaar neerslaat op de plaats van het enzym.
Bekende enzymen die vaak worden gedetecteerd, zijn fosfatase s, dehydrogenases en peroxidases.
Peroxidase kan ook als label worden gebruikt na koppeling aan een antilichaam in een
immunohistochemische studie.
Omdat chemische fixatie en inbedding meestal de aard van enzymen, epitopen en andere specifieke
moleculaire structuren vernietigt of maskeert, maakt men voor cytochemische studies vaak gebruik van
vriescoupes van verse cellen of weefsels. Daarin zijn namelijk nog alle reactieve plaatsen en
wateroplosbare stoffen bewaard.
2
, Samenvattingen
In de immunohistochemie lokaliseert men een antigeen met behulp van een specifiek antilichaam, dat
meestal gelabeld is met een fluorescerende merker of peroxidase voor LM, of kleine gouddeeltjes voor
TEM.
Met de directe methode lokaliseert men een antigeen met een gelabeld primair antilichaam.
Bij de indirecte methode lokaliseert men een antigeen met een ongelabeld primair antilichaam, dat op
zijn beurt met een secundair, gelabeld antilichaam wordt gedetecteerd. Dit is in de praktijk efficiënter,
aangezien het secundaire antilichaam voor verscheidene primaire antilichamen gebruikt kan worden.
In-situhybridisatie kan worden gebruikt om specifieke sequenties in DNA of RNA te lokaliseren in cellen
met behulp van specifieke, gelabelde nucleotidensequenties.
Er is een flink aantal specifieke reacties tussen macromoleculen bekend die gebruikt kunnen worden om
een van de twee in cellen te lokaliseren. Voorbeelden: lectines reageren met suikergroepen, proteïne-A
met immunoglobuline, falloïdine met F-actine.
Interpretatie en belang van microscopie
De procedure voor het maken van microscopische preparaten is omslachtig, tijdrovend en vraagt
specifieke deskundigheid. Dat geldt ook voor het optimaal gebruik van een microscoop en het maken en
interpreteren van de beelden. Daar komt nog bij dat tijdens dit proces artefact en kunnen optreden; dat
wil zeggen dat structuren de novo kunnen ontstaan door het toepassen van de technieken. De
interpretatie daarvan is een bijkomende complicatie.
Coupes zijn tweedimensionale doorsneden van een driedimensionale structuur. Dit speelt een rol in de
interpretatie van de beelden.
3
1. Waarnemingsmethoden
Prepareren van cellen en weefsels voor microscopie
Fixeren dient om het metabolisme te stoppen, de structuur vast te leggen en het weefsel klaar te maken
voor verdere bewerking, zoals coupes maken en kleuren.
Chemische fixatie denatureert eiwitten onder andere door ‘crosslinking’ waarbij enzymen onwerkzaam
worden, maar autolyse voorkomen wordt.
Chemisch fixeren gebeurt door het toepassen van formaldehyde, glutaaraldehyde of osmiumtetroxide,
al dan niet na elkaar of in combinatie.
Fysisch fixeren kan door bevriezen.
Na dehydratie in een alcoholreeks met opklimmende sterkte en impregnatie met paraffine of
monomeer plastic worden kleine weefselstukjes en cellen ingebed.
Paraffinecoupes worden op een microtoom gesneden tot coupes van 5 µm voor LM. Ultradunne coupes
van 50 nm voor TEM worden gesneden op een ultramicrotoom.
Voor SEM geldt een aangepaste procedure.
Coupes worden op een preparaatdrager gebracht (microscoopglaasje of gridje) en gekleurd of
gecontrasteerd met verschillende middelen.
Voor LM is HE-kleuring (hematoxyline / eosine = basische/zure kleurstof) de gangbare kleuring. Voor
TEM worden oplossingen van zware metalen zoals lood- en uranylionen gebruikt.
DNA en RNA kleuren met hematoxyline donkerblauw en worden basofiel genoemd. Eiwitten kleuren
lichtroze met eosine en worden acidofiel of eosinofiel genoemd.
Lichtmicroscopie
Helderveld microscopie maakt gebruik van normaal, wit licht. De aangekleurde celonderdelen in de
coupe komen met deze methode naar voren. Varianten zijn donkerveld- of polarisatie-microscopie .
Fluorescentiemicroscopie gebruikt ultraviolet licht (met kleine golflengte) om fluorescerende moleculen
in een coupe op te sporen op grond van hun emissie van licht met een langere golflengte. Hiermee
kunnen natuurlijke of aangebrachte moleculen en specifieke probes worden opgespoord.
Fasecontrastmicroscopie is gebaseerd op de natuurlijke verschillen in de brekingsindex van cellen en
weefsels. Kleuring is niet nodig, zodat levende cellen in een uitstrijkje of celkweek direct waargenomen
kunnen worden.
Interferentiemicroscopie is vergelijkbaar met fasecontrastmicroscopie, maar vormt een reliëfbeeld.
Confocale microscopie scant een preparaat met een monochrome laserbundel die in een vlak in het
preparaat gefocusseerd wordt. Bij de beeldvorming wordt het fluorescentielicht buiten dit vlak
weggefilterd. Beelden uit opeenvolgende vlakken kunnen door een computer tot een fluorescent 3D-
beeld worden samengesteld.
1
, Samenvattingen
De resolutie van de lichtmicroscopie benadert 0,25 µm. Met behulp van speciale
computerondersteunde technieken kan men nu onder deze grens komen met de superresolutie-
microscoop.
De ‘ atomic-force’-microscoop (AFM) is gebaseerd op een aftastende siliconen sensor, maar in het
onderzoek is deze microscoop nog niet echt doorgebroken.
Elektronenmicroscopie
Als beeldvormend medium hebben elektronen een veel kleinere golflengte, zodat een transmissie-
elektronenmicroscoop (TEM) een hogere resolutie geeft, tot 0,1 nm. Daarmee kan men de
ultrastructuur van cellen en weefsels tot op moleculair niveau bestuderen.
In een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) vormen de elektromagnetische lenzen een
elektronenbundel. Als deze bundel een ultradun preparaat doorstraalt, ontstaat een beeld doordat
zware metalen van de contrastering elektronen uit de bundel ‘wegkaatsen’. Het beeld wordt
weergegeven via een fluorescentiescherm of een camera.
Vriezen en breken van bevroren cellen of weefsels maakt de studie van het gedetailleerde oppervlak
mogelijk. Het oppervlaktereliëf kan nog versterkt worden door vriesetsen, eventueel gevolgd door het
maken van een replica met het opdampen van zware metalen op het oppervlak in een vacuüm.
‘Scanning’-elektronenmicroscopen (SEM) scannen het oppervlak van een preparaat met een
elektronenbundel. Deze weekt uit het preparaat secundaire elektronen los, die vervolgens door een
detector geregistreerd worden. Het preparaat bevindt zich in een vacuüm en is met een dun laagje goud
bedekt om het geleidend te maken.
Cel- en weefselkweek
Door hun relatieve onafhankelijkheid kunnen cellen, nadat ze uit hun weefselverband los zijn gemaakt,
in vitro gekweekt worden in een samengesteld medium. Sommige cellijnen kunnen geruime tijd verder
worden gekweekt. Primaire culturen van vers geïsoleerde cellen worden meestal gedurende een
beperkte tijd gebruikt. Celkweken in een petrischaal worden meestal van onderen bekeken met een
‘invert’-microscoop.
Cyto- en histochemie
Enzymcytochemie maakt gebruik van de restactiviteit van een enzym na ‘zachte’ fixatie. Het
aangeboden substraat wordt omgezet door het enzym, terwijl in het medium een reagens aanwezig is
dat het product van het enzym zichtbaar neerslaat op de plaats van het enzym.
Bekende enzymen die vaak worden gedetecteerd, zijn fosfatase s, dehydrogenases en peroxidases.
Peroxidase kan ook als label worden gebruikt na koppeling aan een antilichaam in een
immunohistochemische studie.
Omdat chemische fixatie en inbedding meestal de aard van enzymen, epitopen en andere specifieke
moleculaire structuren vernietigt of maskeert, maakt men voor cytochemische studies vaak gebruik van
vriescoupes van verse cellen of weefsels. Daarin zijn namelijk nog alle reactieve plaatsen en
wateroplosbare stoffen bewaard.
2
, Samenvattingen
In de immunohistochemie lokaliseert men een antigeen met behulp van een specifiek antilichaam, dat
meestal gelabeld is met een fluorescerende merker of peroxidase voor LM, of kleine gouddeeltjes voor
TEM.
Met de directe methode lokaliseert men een antigeen met een gelabeld primair antilichaam.
Bij de indirecte methode lokaliseert men een antigeen met een ongelabeld primair antilichaam, dat op
zijn beurt met een secundair, gelabeld antilichaam wordt gedetecteerd. Dit is in de praktijk efficiënter,
aangezien het secundaire antilichaam voor verscheidene primaire antilichamen gebruikt kan worden.
In-situhybridisatie kan worden gebruikt om specifieke sequenties in DNA of RNA te lokaliseren in cellen
met behulp van specifieke, gelabelde nucleotidensequenties.
Er is een flink aantal specifieke reacties tussen macromoleculen bekend die gebruikt kunnen worden om
een van de twee in cellen te lokaliseren. Voorbeelden: lectines reageren met suikergroepen, proteïne-A
met immunoglobuline, falloïdine met F-actine.
Interpretatie en belang van microscopie
De procedure voor het maken van microscopische preparaten is omslachtig, tijdrovend en vraagt
specifieke deskundigheid. Dat geldt ook voor het optimaal gebruik van een microscoop en het maken en
interpreteren van de beelden. Daar komt nog bij dat tijdens dit proces artefact en kunnen optreden; dat
wil zeggen dat structuren de novo kunnen ontstaan door het toepassen van de technieken. De
interpretatie daarvan is een bijkomende complicatie.
Coupes zijn tweedimensionale doorsneden van een driedimensionale structuur. Dit speelt een rol in de
interpretatie van de beelden.
3
