Moleculaire genetica – samenvatting
DNA mutaties en repair (H1)
1. Types van DNA mutaties
Mutatie: een blijvende verandering in de DNA-sequentie die wordt doorgegeven
aan dochtercellen tijdens celdelingen. Ze ontstaat door replicatiefouten,
beschadigde nucleotiden en fouten in recombinatie (bij grote DNA-stukken).
Mutaties kunnen leiden tot loss/gain of function en genverdubbeling (nieuwe
eiwitfuncties).
1.1. Puntmutaties (1 basepaar)
Transition mutatie: puntmutatie waarbij een purine door een
andere purine of een pyrimidine door een andere pyrimidine wordt
vervangen.
Transversion mutatie: een puntmutatie waarbij een purine wordt
vervangen door een pyrimidine of omgekeerd.
Silent mutatie: een nucleotideverandering die geen verandering in het aminozuur
van het eiwit veroorzaakt.
Missense mutatie: een nucleotideverandering die leidt tot de inbouw van een
ander aminozuur in het eiwit.
Nonsense mutatie: een nucleotideverandering die een codon omzet in een
stopcodon, waardoor een verkort eiwit ontstaat.
Ontstaan puntmutaties:
• Mismatch door fout van DNA-polymerase of beschadigde base
• Niet hersteld vóór volgende replicatie → vaste mutatie
Na de 2de replicatie is de mutatie niet meer detecteerbaar door repair en dus
erfelijk (bv: sikkelcelanemie → transversion → aminozuurverandering in
hemoglobine).
1.2. InDels (enkele basen)
Indels: mutaties waarbij 1 of meerdere baseparen worden ingevoegd (insertie) of
verwijderd (deletie). Ze ontstaan door foute recombinatie of template slippage
tijdens replicatie. Bij indels van 3 basen blijft het leesraam intact, maar wordt er
een extra aminozuur toegevoegd.
Frameshiftmutatie: indels
van 1 of 2 basen verschuiven
het leesraam, waardoor je een
totaal ander aminozuurpatroon
krijgt en vaak een vroegtijdig
stopcodon.
Triplet repeat expansies: bij template slippage in herhaalde triplets kan het
aantal herhalingen toenemen. Dit leidt tot triplet-expansieziekten, zoals de ziekte
,van Huntington, waarbij het eiwit abnormaal lang wordt en toxisch kan zijn voor de
cel.
1.3. Grote mutaties = chromosomale aberraties
Grote mutaties omvatten veranderingen van grote DNA-fragmenten of volledige
chromosoomdelen en ontstaan meestal door fouten in recombinatie.
Chromosoom deletie: een stuk chromosoom gaat verloren.
Chromosoom insertie: een stuk DNA van ander chromosoom wordt ingevoegd.
Chromosoom duplicatie: een DNA-segment wordt verdubbeld, wat kan leiden tot
verhoogde genexpressie.
Chromosoom inversie: een chromosoomsegment wordt omgekeerd ingebouwd.
Chromosoom translocatie: uitwisseling van DNA-stukken tussen niet-homologe
chromosomen, wat kan leiden tot fusiegenen.
2. DNA-alteraties die leiden tot mutaties
DNA is chemisch niet stabiel en kan voortdurend beschadigd worden door normale
cellulaire processen, omgevingsfactoren en zelfs door de enzymen die DNA moeten
kopiëren en onderhouden. Als deze beschadigingen niet correct hersteld worden,
kunnen ze leiden tot mutaties.
2.1. Spontane schade door water (hydrolyse)
Water veroorzaakt continu hydrolytische reacties in DNA.
Deaminatie: het verlies van een aminogroep (–NH₂) uit een
base. Cytosine deamineert spontaan tot uracil, dat met adenine
paart in plaats van guanine. Adenine deamineert tot hypoxanthine,
dat met cytosine paart. Guanine deamineert tot xanthine, wat
minder schadelijk is omdat het nog met cytosine kan paren. Als
deaminatie niet vóór replicatie wordt hersteld, ontstaat een
transition mutatie.
5-methylcytosine deamineert tot thymine. Dit is extra gevaarlijk
omdat thymine normaal in DNA voorkomt, waardoor deze schade
moeilijk te detecteren is. Dit maakt CpG-plaatsen hotspots voor
mutaties.
2.2. Abasische sites (depurinatie/ depyrimidinatie)
Abasische site: de DNA-ruggengraat is intact, maar de base
ontbreekt. Dit kan door een hydrolyse die de N-glycosidische
binding tussen base en suiker verbreken. Dit gebeurt vooral bij
purines (depurinatie). Tijdens replicatie vult DNA-polymerase vaak een
willekeurige base in → mutatie.
2.3. Oxidatieve schade
,Tijdens aerobe stofwisseling ontstaan reactieve
zuurstofspecies (ROS) zoals waterstofperoxide,
superoxide en hydroxylradicalen Deze kunnen basen
oxideren, suikers beschadigen en enkel- en
dubbelstrengsbreuken veroorzaken.
8-oxo-guanine: oxidatie van guanine vormt 8-oxo-G. 8-
oxo-G kan paren met adenine i.p.v. cytosine. Dit leidt
tot een GC → TA transversion.
2.4. Alkylatie
Alkylatie: de toevoeging van een alkylgroep (bv. –CH₃) aan basen of de
fosfaatruggengraat. Veel alkylaterende stoffen zijn carcinogeen (= kanker
stimulerend). Dit zorgt voor verstoorde baseparing, blokkade van replicatie en
mutaties als de schade niet hersteld wordt.
Ames test: test of een stof mutageen is. Het gebruikt His⁻ bacteriën (kunnen
geen histidine maken). Als het mutageen is, is er een reversiemutatie en groeien de
bacteriën zonder histidine. Mutagenen zijn vaak ook carcinogenen.
2.5. Schade door straling
UV-straling: UV veroorzaakt covalente crosslinks tussen aangrenzende
pyrimidines. Meest typisch zijn thymine-dimeren. Deze vervormen het DNA en
blokkeren replicatie.
Ioniserende straling (X- en γ-stralen): veroorzaakt ROS en enkel- of
dubbelstrengsbreuken. Dubbelstrengsbreuken zijn het gevaarlijkst. Herstel gebeurt
via homologe recombinatie of non-homologous end joining (NHEJ, foutgevoelig).
2.6. Replicatie- en recombinatiefouten
DNA-polymerase maakt soms fouten ondanks proofreading. Tautomeervormen
van basen kunnen verkeerde paringen veroorzaken. Template slippage bij
repetitieve sequenties leidt tot inserties en deleties. Beschadigde templates kunnen
gerepliceerd worden door translesion polymerases, die foutgevoelig zijn.
3. DNA repairmechanismen
3.1. Mismatch repair (MMR)
Mismatch repair (MMR): corrigeert fouten die ontstaan tijdens DNA-replicatie,
wanneer DNA-polymerase een verkeerd nucleotide inbouwt. Dit systeem is
geconserveerd in alle celtypes. Het herstelt mismatch baseparen ontstaan tijdens
replicatie en kleine insertie/deletielussen van minder dan 4 baseparen,
veroorzaakt door template slippage tijdens replicatie of kleine recombinatielussen.
Lussen groter dan 4 bp worden niet herkend door MMR en er bestaat geen
alternatief correctiemechanisme, deze fouten blijven bestaan. De energiekost van
dit proces is veel lager dan de kost van blijvende mutaties. Mutaties in MMR-genen
, leiden tot accumulatie van mutaties in het genoom, omdat mismatches en korte
indels niet meer hersteld worden.
Strengdiscriminatie: omdat beide strengen intact zijn (geen beschadigde base),
moet de cel bepalen welke streng foutief is. In prokaryoten methylleert Dam-
methylase adenine op de N6-positie in de sequentie 5’-GATC-3’. Oud
(parentaal) DNA is al volledig gemethyleerd. De nieuw gesynthetiseerde streng is
tijdelijk ongemethyleerd. Dit hemimethyleerde stadium maakt
strengdiscriminatie mogelijk.
In eukaryoten is er geen DNA-methylatie voor strengdiscriminatie. De herkenning
gebaseerd op nicks in de nieuw gesynthetiseerde streng. De excisie vereist geen
helicase.
Stappen van MMR
I. Mismatch veroorzaakt
DNA-vervorming
• Herkend door MutS
(homodimeer: MutS₂)
II. Complexvorming
• MutS bindt de mismatch
• Rekrutering van MutL →
MutS₂–MutL₂-complex
• ATP-afhankelijk
III.DNA-scanning
• Complex scant
bidirectioneel langs het
DNA
• Vorming van een DNA-
loop
IV. Herkenning GATC-site
• Bij een hemimethyleerde GATC-site wordt MutH gerekruteerd
• MutH = site-specifieke endonuclease
• Knipt enkel de ongemethyleerde (nieuwe) streng
V. Excisie
• UvrD (helicase II) ontwindt het DNA richting mismatch
• Exonuclease degradeert DNA voorbij de mismatch
• Afbraak stopt kort na verwijdering van de fout
• Resultaat: single-strand gap tussen GATC-site en mismatch
VI. Herstel
• Single strand DNA-binding protein (SSB) stabiliseert enkelstrengs DNA
• DNA-polymerase III holo-enzym vult de kloof
• DNA-ligase sluit de breuk
3.2. Direct repair
DNA mutaties en repair (H1)
1. Types van DNA mutaties
Mutatie: een blijvende verandering in de DNA-sequentie die wordt doorgegeven
aan dochtercellen tijdens celdelingen. Ze ontstaat door replicatiefouten,
beschadigde nucleotiden en fouten in recombinatie (bij grote DNA-stukken).
Mutaties kunnen leiden tot loss/gain of function en genverdubbeling (nieuwe
eiwitfuncties).
1.1. Puntmutaties (1 basepaar)
Transition mutatie: puntmutatie waarbij een purine door een
andere purine of een pyrimidine door een andere pyrimidine wordt
vervangen.
Transversion mutatie: een puntmutatie waarbij een purine wordt
vervangen door een pyrimidine of omgekeerd.
Silent mutatie: een nucleotideverandering die geen verandering in het aminozuur
van het eiwit veroorzaakt.
Missense mutatie: een nucleotideverandering die leidt tot de inbouw van een
ander aminozuur in het eiwit.
Nonsense mutatie: een nucleotideverandering die een codon omzet in een
stopcodon, waardoor een verkort eiwit ontstaat.
Ontstaan puntmutaties:
• Mismatch door fout van DNA-polymerase of beschadigde base
• Niet hersteld vóór volgende replicatie → vaste mutatie
Na de 2de replicatie is de mutatie niet meer detecteerbaar door repair en dus
erfelijk (bv: sikkelcelanemie → transversion → aminozuurverandering in
hemoglobine).
1.2. InDels (enkele basen)
Indels: mutaties waarbij 1 of meerdere baseparen worden ingevoegd (insertie) of
verwijderd (deletie). Ze ontstaan door foute recombinatie of template slippage
tijdens replicatie. Bij indels van 3 basen blijft het leesraam intact, maar wordt er
een extra aminozuur toegevoegd.
Frameshiftmutatie: indels
van 1 of 2 basen verschuiven
het leesraam, waardoor je een
totaal ander aminozuurpatroon
krijgt en vaak een vroegtijdig
stopcodon.
Triplet repeat expansies: bij template slippage in herhaalde triplets kan het
aantal herhalingen toenemen. Dit leidt tot triplet-expansieziekten, zoals de ziekte
,van Huntington, waarbij het eiwit abnormaal lang wordt en toxisch kan zijn voor de
cel.
1.3. Grote mutaties = chromosomale aberraties
Grote mutaties omvatten veranderingen van grote DNA-fragmenten of volledige
chromosoomdelen en ontstaan meestal door fouten in recombinatie.
Chromosoom deletie: een stuk chromosoom gaat verloren.
Chromosoom insertie: een stuk DNA van ander chromosoom wordt ingevoegd.
Chromosoom duplicatie: een DNA-segment wordt verdubbeld, wat kan leiden tot
verhoogde genexpressie.
Chromosoom inversie: een chromosoomsegment wordt omgekeerd ingebouwd.
Chromosoom translocatie: uitwisseling van DNA-stukken tussen niet-homologe
chromosomen, wat kan leiden tot fusiegenen.
2. DNA-alteraties die leiden tot mutaties
DNA is chemisch niet stabiel en kan voortdurend beschadigd worden door normale
cellulaire processen, omgevingsfactoren en zelfs door de enzymen die DNA moeten
kopiëren en onderhouden. Als deze beschadigingen niet correct hersteld worden,
kunnen ze leiden tot mutaties.
2.1. Spontane schade door water (hydrolyse)
Water veroorzaakt continu hydrolytische reacties in DNA.
Deaminatie: het verlies van een aminogroep (–NH₂) uit een
base. Cytosine deamineert spontaan tot uracil, dat met adenine
paart in plaats van guanine. Adenine deamineert tot hypoxanthine,
dat met cytosine paart. Guanine deamineert tot xanthine, wat
minder schadelijk is omdat het nog met cytosine kan paren. Als
deaminatie niet vóór replicatie wordt hersteld, ontstaat een
transition mutatie.
5-methylcytosine deamineert tot thymine. Dit is extra gevaarlijk
omdat thymine normaal in DNA voorkomt, waardoor deze schade
moeilijk te detecteren is. Dit maakt CpG-plaatsen hotspots voor
mutaties.
2.2. Abasische sites (depurinatie/ depyrimidinatie)
Abasische site: de DNA-ruggengraat is intact, maar de base
ontbreekt. Dit kan door een hydrolyse die de N-glycosidische
binding tussen base en suiker verbreken. Dit gebeurt vooral bij
purines (depurinatie). Tijdens replicatie vult DNA-polymerase vaak een
willekeurige base in → mutatie.
2.3. Oxidatieve schade
,Tijdens aerobe stofwisseling ontstaan reactieve
zuurstofspecies (ROS) zoals waterstofperoxide,
superoxide en hydroxylradicalen Deze kunnen basen
oxideren, suikers beschadigen en enkel- en
dubbelstrengsbreuken veroorzaken.
8-oxo-guanine: oxidatie van guanine vormt 8-oxo-G. 8-
oxo-G kan paren met adenine i.p.v. cytosine. Dit leidt
tot een GC → TA transversion.
2.4. Alkylatie
Alkylatie: de toevoeging van een alkylgroep (bv. –CH₃) aan basen of de
fosfaatruggengraat. Veel alkylaterende stoffen zijn carcinogeen (= kanker
stimulerend). Dit zorgt voor verstoorde baseparing, blokkade van replicatie en
mutaties als de schade niet hersteld wordt.
Ames test: test of een stof mutageen is. Het gebruikt His⁻ bacteriën (kunnen
geen histidine maken). Als het mutageen is, is er een reversiemutatie en groeien de
bacteriën zonder histidine. Mutagenen zijn vaak ook carcinogenen.
2.5. Schade door straling
UV-straling: UV veroorzaakt covalente crosslinks tussen aangrenzende
pyrimidines. Meest typisch zijn thymine-dimeren. Deze vervormen het DNA en
blokkeren replicatie.
Ioniserende straling (X- en γ-stralen): veroorzaakt ROS en enkel- of
dubbelstrengsbreuken. Dubbelstrengsbreuken zijn het gevaarlijkst. Herstel gebeurt
via homologe recombinatie of non-homologous end joining (NHEJ, foutgevoelig).
2.6. Replicatie- en recombinatiefouten
DNA-polymerase maakt soms fouten ondanks proofreading. Tautomeervormen
van basen kunnen verkeerde paringen veroorzaken. Template slippage bij
repetitieve sequenties leidt tot inserties en deleties. Beschadigde templates kunnen
gerepliceerd worden door translesion polymerases, die foutgevoelig zijn.
3. DNA repairmechanismen
3.1. Mismatch repair (MMR)
Mismatch repair (MMR): corrigeert fouten die ontstaan tijdens DNA-replicatie,
wanneer DNA-polymerase een verkeerd nucleotide inbouwt. Dit systeem is
geconserveerd in alle celtypes. Het herstelt mismatch baseparen ontstaan tijdens
replicatie en kleine insertie/deletielussen van minder dan 4 baseparen,
veroorzaakt door template slippage tijdens replicatie of kleine recombinatielussen.
Lussen groter dan 4 bp worden niet herkend door MMR en er bestaat geen
alternatief correctiemechanisme, deze fouten blijven bestaan. De energiekost van
dit proces is veel lager dan de kost van blijvende mutaties. Mutaties in MMR-genen
, leiden tot accumulatie van mutaties in het genoom, omdat mismatches en korte
indels niet meer hersteld worden.
Strengdiscriminatie: omdat beide strengen intact zijn (geen beschadigde base),
moet de cel bepalen welke streng foutief is. In prokaryoten methylleert Dam-
methylase adenine op de N6-positie in de sequentie 5’-GATC-3’. Oud
(parentaal) DNA is al volledig gemethyleerd. De nieuw gesynthetiseerde streng is
tijdelijk ongemethyleerd. Dit hemimethyleerde stadium maakt
strengdiscriminatie mogelijk.
In eukaryoten is er geen DNA-methylatie voor strengdiscriminatie. De herkenning
gebaseerd op nicks in de nieuw gesynthetiseerde streng. De excisie vereist geen
helicase.
Stappen van MMR
I. Mismatch veroorzaakt
DNA-vervorming
• Herkend door MutS
(homodimeer: MutS₂)
II. Complexvorming
• MutS bindt de mismatch
• Rekrutering van MutL →
MutS₂–MutL₂-complex
• ATP-afhankelijk
III.DNA-scanning
• Complex scant
bidirectioneel langs het
DNA
• Vorming van een DNA-
loop
IV. Herkenning GATC-site
• Bij een hemimethyleerde GATC-site wordt MutH gerekruteerd
• MutH = site-specifieke endonuclease
• Knipt enkel de ongemethyleerde (nieuwe) streng
V. Excisie
• UvrD (helicase II) ontwindt het DNA richting mismatch
• Exonuclease degradeert DNA voorbij de mismatch
• Afbraak stopt kort na verwijdering van de fout
• Resultaat: single-strand gap tussen GATC-site en mismatch
VI. Herstel
• Single strand DNA-binding protein (SSB) stabiliseert enkelstrengs DNA
• DNA-polymerase III holo-enzym vult de kloof
• DNA-ligase sluit de breuk
3.2. Direct repair
