Het zuiveren en analyseren van Albumine uit serum
Datum 10 juli 2020
Naam Inge Slootbeek
Labpartner n.v.t.
Docent Marco van der Stoep
Inleiding
Tijdens het experiment wordt er albumine uit serum met behulp van affiniteitschromatografie en de
opbrengst van deze zuivering wordt geanalyseerd met behulp van SDS-PAGE.
Affiniteitschromatografie is een methode die wordt gebruikt om stoffen van elkaar te gescheiden.
Met behulp van affiniteitschromatografie kunnen enkele verbindingen uit een complex mengsel
worden gehaald. Hierbij is de methode gebaseerd op een covalente binding, die erg specifiek is, van
een enkele verbinding aan de stationaire fase van de kolom. De rest van het complexe mengsel
wordt van de kolom afgespoeld en je enkele verbinding van interesse blijft achter in de kolom. Zodra
je bijvoorbeeld de pH of ion sterkte veranderd, zal de covalente binding met je enkele verbinding
verbreken en kan deze van de kolom worden afgespoeld.
SDS-PAGE wordt gebruikt vanwege het vermogen om complexe mengsels van moleculen te scheiden
op grootte en lading. SDS-PAGE wordt veel gebruikt voor het scheiden van eiwitten. Hierbij worden
de eiwitten vooraf gedenatureerd door opkoken in de aanwezigheid van het detergens SDS en de
reducerende stof beta-mercapto-ethanol. Het gevolg hiervan is dat de eiwitmoleculen worden
uitgestrekt als polypeptide ketens en naar ratio van del engte bedenkt een hoeveelheid SDS
moleculen die voor de negatieve over-all lading zorgen. In de gel en de buffers is ook SDS aanwezig
die ervoor zorgt dat de eiwitten gedenatureerd blijven tijdens het runnen van de gel. Deze eiwitten
worden gescheiden op grootte van de eiwitten.
In figuur 1 staan de verwachtingen van de verschillende fragmenten die zichtbaar zullen worden na
affiniteitschromatografie en SDS-PAGE. Hierin is te zien dat er in monster #1 heel veel verschillende
eiwitten, afkomstig uit het serum, zullen zitten. In monster #2 zal er voor het eerst elutie buffer
worden toegevoegd, hierdoor zullen er al veel minder rest eiwitten aanwezig zijn & ook het albumine
komt hier al uit de kolom. In monster #3 en #4 is de verwachting dat er alleen nog albumine zichtbaar
is, alle rest eiwitten zijn er bij de vorige stappen uitgehaald en alleen albumine is over. De
concentratie van albumine in serum ligt bij volwassen mensen tussen de 35 – 50 g/L. De verwachting
van dit experiment is dat de concentratie albumine in serum tussen dit interval zal liggen.
,Figuur 1. Verwachting van de SDS-PAGE van gezuiverde albumine en verdunningsreeks BSA. Laan 1, 2, 3 en 4
van links monsters na affiniteitschromatografie. Laan 5, 6, 7 en 8 vanaf links is de verdunningsreeks van BSA te
zien. Laan 10, rechter laantje, bevat de ladder met verschillende eiwitten. BSA is te vinden bij een grootte van
ongeveer 66,5 kDa.
, Materiaal & methode
Het experiment is uitgevoerd met behulp van het voorschrift “Het zuiveren van albumine uit serum
met Affi-Gel blue gel affiniteitschromatografie” en het voorschrift “Analyse van eiwitmonsters met
Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Elektroforese (SDS-PAGE)”, te vinden in de cursus
Labvaardigheden 4 op Moodle.
Materiaal Fabrikant Lotnummer
Analysemonsters Inholland Amsterdam Serum20200526
Inholland Amsterdam Serum20200526
Affi-gel Blue Bio Rad 64206931
Kolom Bio Rad 64040622
Sodium chloride Arcos organics A0383770
Sodium phosphate dibasic Arcos organics A0408600
Statief Inholland Amsterdam -
Bekerglas Inholland Amsterdam -
Centrifuge Eppendorf (centrifuge 5810) INH000353
Hitteblok Thermo Scientific -
40% Acrylamide/Bis Bio Rad 1610146
Ammonium Persulphate Bio Rad 161-0700
Azijnzuur CHEM-LAB 233362209
2x Laemmli Sample Buffer Bio Rad 161-0737
Methanol Arcos Organics A0368049
Resolving Gel Buffer Bio Rad 161-0798
SDS 10% Fisher Scientific 162807
Stacking Gel Buffer Bio Rad 161-0799
TEMED Bio Rad 161-0800
10x TGS Buffer Bio Rad 161-0772
Gel frame Bio Rad SDS1.2
Kam Bio Rad
Spatel Bio Rad
Electrode running module Bio Rad
Glasplaat met spacer Bio Rad
Glasplaat zonder spacer Bio Rad
Bufferdam Bio Rad
Castingframe Bio Rad
Doseerpipet Eppendorf -
Voorbereiden van de resolving gel (10%):
Water 4,1 mL
40% acrylamide/Bis 3,3 mL
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) 2,5 mL
10% SDS 0,1 mL
Eindvolume 10 mL
Datum 10 juli 2020
Naam Inge Slootbeek
Labpartner n.v.t.
Docent Marco van der Stoep
Inleiding
Tijdens het experiment wordt er albumine uit serum met behulp van affiniteitschromatografie en de
opbrengst van deze zuivering wordt geanalyseerd met behulp van SDS-PAGE.
Affiniteitschromatografie is een methode die wordt gebruikt om stoffen van elkaar te gescheiden.
Met behulp van affiniteitschromatografie kunnen enkele verbindingen uit een complex mengsel
worden gehaald. Hierbij is de methode gebaseerd op een covalente binding, die erg specifiek is, van
een enkele verbinding aan de stationaire fase van de kolom. De rest van het complexe mengsel
wordt van de kolom afgespoeld en je enkele verbinding van interesse blijft achter in de kolom. Zodra
je bijvoorbeeld de pH of ion sterkte veranderd, zal de covalente binding met je enkele verbinding
verbreken en kan deze van de kolom worden afgespoeld.
SDS-PAGE wordt gebruikt vanwege het vermogen om complexe mengsels van moleculen te scheiden
op grootte en lading. SDS-PAGE wordt veel gebruikt voor het scheiden van eiwitten. Hierbij worden
de eiwitten vooraf gedenatureerd door opkoken in de aanwezigheid van het detergens SDS en de
reducerende stof beta-mercapto-ethanol. Het gevolg hiervan is dat de eiwitmoleculen worden
uitgestrekt als polypeptide ketens en naar ratio van del engte bedenkt een hoeveelheid SDS
moleculen die voor de negatieve over-all lading zorgen. In de gel en de buffers is ook SDS aanwezig
die ervoor zorgt dat de eiwitten gedenatureerd blijven tijdens het runnen van de gel. Deze eiwitten
worden gescheiden op grootte van de eiwitten.
In figuur 1 staan de verwachtingen van de verschillende fragmenten die zichtbaar zullen worden na
affiniteitschromatografie en SDS-PAGE. Hierin is te zien dat er in monster #1 heel veel verschillende
eiwitten, afkomstig uit het serum, zullen zitten. In monster #2 zal er voor het eerst elutie buffer
worden toegevoegd, hierdoor zullen er al veel minder rest eiwitten aanwezig zijn & ook het albumine
komt hier al uit de kolom. In monster #3 en #4 is de verwachting dat er alleen nog albumine zichtbaar
is, alle rest eiwitten zijn er bij de vorige stappen uitgehaald en alleen albumine is over. De
concentratie van albumine in serum ligt bij volwassen mensen tussen de 35 – 50 g/L. De verwachting
van dit experiment is dat de concentratie albumine in serum tussen dit interval zal liggen.
,Figuur 1. Verwachting van de SDS-PAGE van gezuiverde albumine en verdunningsreeks BSA. Laan 1, 2, 3 en 4
van links monsters na affiniteitschromatografie. Laan 5, 6, 7 en 8 vanaf links is de verdunningsreeks van BSA te
zien. Laan 10, rechter laantje, bevat de ladder met verschillende eiwitten. BSA is te vinden bij een grootte van
ongeveer 66,5 kDa.
, Materiaal & methode
Het experiment is uitgevoerd met behulp van het voorschrift “Het zuiveren van albumine uit serum
met Affi-Gel blue gel affiniteitschromatografie” en het voorschrift “Analyse van eiwitmonsters met
Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Elektroforese (SDS-PAGE)”, te vinden in de cursus
Labvaardigheden 4 op Moodle.
Materiaal Fabrikant Lotnummer
Analysemonsters Inholland Amsterdam Serum20200526
Inholland Amsterdam Serum20200526
Affi-gel Blue Bio Rad 64206931
Kolom Bio Rad 64040622
Sodium chloride Arcos organics A0383770
Sodium phosphate dibasic Arcos organics A0408600
Statief Inholland Amsterdam -
Bekerglas Inholland Amsterdam -
Centrifuge Eppendorf (centrifuge 5810) INH000353
Hitteblok Thermo Scientific -
40% Acrylamide/Bis Bio Rad 1610146
Ammonium Persulphate Bio Rad 161-0700
Azijnzuur CHEM-LAB 233362209
2x Laemmli Sample Buffer Bio Rad 161-0737
Methanol Arcos Organics A0368049
Resolving Gel Buffer Bio Rad 161-0798
SDS 10% Fisher Scientific 162807
Stacking Gel Buffer Bio Rad 161-0799
TEMED Bio Rad 161-0800
10x TGS Buffer Bio Rad 161-0772
Gel frame Bio Rad SDS1.2
Kam Bio Rad
Spatel Bio Rad
Electrode running module Bio Rad
Glasplaat met spacer Bio Rad
Glasplaat zonder spacer Bio Rad
Bufferdam Bio Rad
Castingframe Bio Rad
Doseerpipet Eppendorf -
Voorbereiden van de resolving gel (10%):
Water 4,1 mL
40% acrylamide/Bis 3,3 mL
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) 2,5 mL
10% SDS 0,1 mL
Eindvolume 10 mL
