Moleculaire Biologie
Samenvatting van alle leerdoelen | Biologie en Medisch Laboratorium onderzoek HU
Inhoud
DNA-replica,e & moleculair kloneren ............................................................................................................. 3
De structuren van DNA en RNA onderscheiden en beschrijven .......................................................................... 3
De PCR-techniek uitleggen en gevolgen van wijzigingen in het protocol uitleggen ........................................... 3
Primers ontwerpen en de zaken waar rekening mee gehouden moet worden uitleggen................................... 4
De processen en de regulaBe van DNA-replicaBe iniBaBe, elongaBe en terminaBe uitleggen en de verschillen
tussen pro- en eukaryoten benoemen ................................................................................................................ 5
Elementen en funcBe van verschillende onderdelen van een plasmide uitleggen .............................................. 8
Het maken van cDNA uitleggen en de toepassing hiervan ............................................................................... 10
Uitschrijven hoe DNA er uit ziet na restricBe en bepalen welke restricBe-enzymen compaBbel zijn met elkaar 9
De verschillende stappen van een kloneerstrategie noemen en uitleggen ....................................................... 10
Extra info .......................................................................................................................................................... 12
Transcrip,e & mRNA expressie analyse ......................................................................................................... 13
De processen en de regulaBe van transcripBe iniBaBe, elongaBe en terminaBe uitleggen en de verschillen
tussen pro- en eukaryoten benoemen .............................................................................................................. 13
RegulaBe van het tryptofaan operon uitleggen................................................................................................ 16
RegulaBe van het lac operon uitleggen en de toepassing hiervan in blauw-wit screening .............................. 16
De verschillende stappen in mRNA processing uitleggen en de verschillen tussen pro- en eukaryoten
benoemen ......................................................................................................................................................... 17
DNA-bindende domeinen herkennen en rol in DNA-binding uitleggen ............................................................. 18
EpigeneBsche begrippen zoals histon- en DNA-modificaBes uitleggen en de rol hiervan in genexpressie ....... 19
Het principe van Sanger sequencing uitleggen en de data ervan interpreteren............................................... 20
De funcBe, structuur en synthese van verschillende typen (small) RNAs.......................................................... 21
De mechanismen die een rol spelen in mRNA stabiliteit in zowel eukaryoot als prokaryoot uitleggen ............ 22
Het doel en principe van qPCR uitleggen en de data ervan interpreteren ........................................................ 24
Extra info .......................................................................................................................................................... 25
Transla,e & Reverse gene,cs ........................................................................................................................ 26
De processen en de regulaBe van translaBe iniBaBe, elongaBe en terminaBe uitleggen en de verschillen
tussen pro- en eukaryoten benoemen .............................................................................................................. 26
Beschrijven hoe eiwiXen gevouwen en afgebroken worden ............................................................................ 28
EiwitmodificaBes benoemen en het effect op eiwiZuncBe uitleggen ............................................................... 29
Toepassingen van reverse geneBcs en het effect hiervan op eiwitniveau uitleggen ........................................ 29
Uitleggen op welke manier expressieniveaus van een eiwit gemanipuleerd kunnen worden .......................... 30
1
, Reportergenen benoemen en hun toepassing binnen het moleculair onderzoek ............................................. 30
Extra info .......................................................................................................................................................... 31
Mutagenese & Iden,fica,e van muta,es ...................................................................................................... 32
De verschillende typen mutaBes benoemen en het gevolg hiervan op eiwitniveau uitleggen ......................... 32
Oorzaken van het ontstaan van mutaBes benoemen en de gevolgen hiervan op replicaBe uitleggen ............ 33
De verschillende DNA repair mechanismen uitleggen en benoemen wanneer deze gebruikt worden............. 35
Uitleggen hoe FISH gebruikt worden in het opsporen van mutaBes ................................................................ 37
Het principe achter een aantal Next GeneraBon Sequencing technieken uitleggen en de voor- en nadelen ten
opzichte van Sanger sequencing benoemen ..................................................................................................... 37
De principes achter site-directed mutagenesis uitleggen en primers hiervoor ontwerpen .............................. 39
Het principe achter CRISPR uitleggen en de toepassingen hiervan in het maken van knock-outs/knock-ins ... 39
Begrippenlijst............................................................................................... Fout! Bladwijzer niet gedefinieerd.
2
,DNA-replica-e & moleculair kloneren
De structuren van DNA en RNA onderscheiden en beschrijven
Elk monomeer in een enkele DNA-streng (elke nucleoBde) bestaat uit drie
delen: een vijf-koolstof suiker (deoxyribose), een fosfaatgroep en een base;
adenine (A), guanine (G), cytosine (C) en thymine (T).
Basenparen: A bindt met T en C bindt met G.
In tegenstelling tot de covalente suiker-fosfaat bindingen van de backbone,
zijn de waterstoRruggen tussen de basenparen zwak, waardoor twee DNA-
strengen van elkaar kunnen worden gescheiden zonder dat de backbone
breekt.
Tussen het basenpaar C en G vormen zich 3 waterstoRruggen en tussen het
basepaar A en T vormen zich 2 waterstoRruggen.
De twee DNA-strengen lopen anBparallel van elkaar. De
nucleoBden worden covalent aan elkaar gebonden door een
fosfaatdiëster binding die het 3’ -hydroxyl (-OH) groep van een
suiker bindt aan de 5’ fosfaat (-PO3).
De uiteinden van de DNA-streng verschillen: een eind heeZ een
fosfaatgroep gebonden aan een 5’ koolstof en het andere eind
heeZ een hydroxyl groep gebonden aan een 3’ koolstof.
RNA is enkelstrengs en heeZ een ribose als suiker, ook is een van
de vier basen anders, namelijk uracil (U) in plaats van thymine (T).
Hetzelfde segment van DNA kan herhaaldelijk worden gebruikt
voor de synthese van vele idenBeke RNA-moleculen.
Uracil, cytosine en thymine zijn
pyrimidines. Adenine en guanine zijn
purines.
De fosfaten zijn gebonden aan het 5e
C atoom van een ribose of een
deoxyribose. De fosfaatgroep zorgt
ervoor dat de nucleoBde negaBef
geladen is.
3
, De PCR-techniek uitleggen en gevolgen van wijzigingen in het protocol uitleggen
PCR is een methode om een specifiek stuk DNA te amplificeren m.b.v. DNA-polymerase. DNA-
polymerase hebben primers nodig, er is alBjd een Forward en Reverse primer.
Primers geven PCR een enorme specificiteit (als ze maar lang genoeg zijn), doordat ze een specifieke
sequenBe hebben die alleen kan binden aan een specifieke DNA-sequenBe.
PCR gebruikt een thermostabiele DNA-polymerase; Taq polymerase, dit is geïsoleerd uit een
hi`ebestendige bacterie. Taq-polymerase werkt het best bij 70 °C.
De reacBemix voor PCR bestaat uit: DNA met target sequenBe, primer paar, Taq polymerase,
voldoende nucleoBden (A, T, C, G, dNTP’s) en reacBebuffer met MgCl2 (dit verhoogt de acBviteit van
DNA-polymerase).
PCR stappen:
I. DenaturaBe: van dubbelstrengs DNA naar enkelstrengs DNA, breken van waterstoRruggen
tussen de basenparen, gebeurt bij 94/95 °C en duurt 30 seconden
II. HybridisaBe (annealing): specifieke primers binden, gebeurt bij 50-60 °C (ahankelijk van de
primer; veel bindingen = hogere temperatuur) en duurt 15-30 seconden. Bij een te lage
annealingtemperatuur worden de primers aspecifiek en binden ze op heel veel plekken.
III. ElongaBe: DNA-polymerase bouwt nieuwe nucleoBde aan en syntheBseert zo een nieuwe
streng DNA. De duur van elongaBe is ahankelijk van de groo`e van het fragment en de
snelheid van de Taq polymerase, de temperatuur is 72 °C.
Primers ontwerpen en de zaken waar rekening mee gehouden moet worden uitleggen
Smel`emperatuur (Tm): Temperatuur waarbij een primer (theoreBsch) loslaat van zijn template. Ligt
bij voorkeur tussen de 55°C en 65°C. Vuistregel: Tm = 4(G + C) + 2(A + T) °C.
Annealingstemperatuur (Ta): Temperatuur waarbij men primers laat hechten aan template à Vaak
~5°C onder de gemiddelde Tm van de primers. Exacte Ta moet empirisch worden bepaald.
Richtlijnen primer ontwerpen:
1. Lengte: 17-28 nucleoBden. Bij langer wordt annealing moeilijker en bij korter heb je minder
specificiteit.
2. GC-gehalte: 50-60%. Hoger is te hoge smel`emperatuur en lager is minder specificiteit.
3. Forward en reverse primers moeten ongeveer dezelfde smel`emperatuur hebben (binnen
5°C).
4. Primers moeten aan 3’ zijde eindigen op G of C à voorkomt loslaten.
5. Niet meer dan drie C’s of G’s aan 3’ uiteinde à primer bindt dan te makkelijk aan (verkeerde)
G of C rijke gebieden in het target DNA.
6. Er mag geen baseparing mogelijk zijn in de primer zelf (self-annealing) of
tussen de twee primers (primer-dimer).
Als de DNA-sequenBe als volgt is:
5’ GCTGAATCGA----------GGGTACCGTA 3’
Dan is de forward primer: GCTGAATCGA
En de reverse primer: TACGGTACCC
4
Samenvatting van alle leerdoelen | Biologie en Medisch Laboratorium onderzoek HU
Inhoud
DNA-replica,e & moleculair kloneren ............................................................................................................. 3
De structuren van DNA en RNA onderscheiden en beschrijven .......................................................................... 3
De PCR-techniek uitleggen en gevolgen van wijzigingen in het protocol uitleggen ........................................... 3
Primers ontwerpen en de zaken waar rekening mee gehouden moet worden uitleggen................................... 4
De processen en de regulaBe van DNA-replicaBe iniBaBe, elongaBe en terminaBe uitleggen en de verschillen
tussen pro- en eukaryoten benoemen ................................................................................................................ 5
Elementen en funcBe van verschillende onderdelen van een plasmide uitleggen .............................................. 8
Het maken van cDNA uitleggen en de toepassing hiervan ............................................................................... 10
Uitschrijven hoe DNA er uit ziet na restricBe en bepalen welke restricBe-enzymen compaBbel zijn met elkaar 9
De verschillende stappen van een kloneerstrategie noemen en uitleggen ....................................................... 10
Extra info .......................................................................................................................................................... 12
Transcrip,e & mRNA expressie analyse ......................................................................................................... 13
De processen en de regulaBe van transcripBe iniBaBe, elongaBe en terminaBe uitleggen en de verschillen
tussen pro- en eukaryoten benoemen .............................................................................................................. 13
RegulaBe van het tryptofaan operon uitleggen................................................................................................ 16
RegulaBe van het lac operon uitleggen en de toepassing hiervan in blauw-wit screening .............................. 16
De verschillende stappen in mRNA processing uitleggen en de verschillen tussen pro- en eukaryoten
benoemen ......................................................................................................................................................... 17
DNA-bindende domeinen herkennen en rol in DNA-binding uitleggen ............................................................. 18
EpigeneBsche begrippen zoals histon- en DNA-modificaBes uitleggen en de rol hiervan in genexpressie ....... 19
Het principe van Sanger sequencing uitleggen en de data ervan interpreteren............................................... 20
De funcBe, structuur en synthese van verschillende typen (small) RNAs.......................................................... 21
De mechanismen die een rol spelen in mRNA stabiliteit in zowel eukaryoot als prokaryoot uitleggen ............ 22
Het doel en principe van qPCR uitleggen en de data ervan interpreteren ........................................................ 24
Extra info .......................................................................................................................................................... 25
Transla,e & Reverse gene,cs ........................................................................................................................ 26
De processen en de regulaBe van translaBe iniBaBe, elongaBe en terminaBe uitleggen en de verschillen
tussen pro- en eukaryoten benoemen .............................................................................................................. 26
Beschrijven hoe eiwiXen gevouwen en afgebroken worden ............................................................................ 28
EiwitmodificaBes benoemen en het effect op eiwiZuncBe uitleggen ............................................................... 29
Toepassingen van reverse geneBcs en het effect hiervan op eiwitniveau uitleggen ........................................ 29
Uitleggen op welke manier expressieniveaus van een eiwit gemanipuleerd kunnen worden .......................... 30
1
, Reportergenen benoemen en hun toepassing binnen het moleculair onderzoek ............................................. 30
Extra info .......................................................................................................................................................... 31
Mutagenese & Iden,fica,e van muta,es ...................................................................................................... 32
De verschillende typen mutaBes benoemen en het gevolg hiervan op eiwitniveau uitleggen ......................... 32
Oorzaken van het ontstaan van mutaBes benoemen en de gevolgen hiervan op replicaBe uitleggen ............ 33
De verschillende DNA repair mechanismen uitleggen en benoemen wanneer deze gebruikt worden............. 35
Uitleggen hoe FISH gebruikt worden in het opsporen van mutaBes ................................................................ 37
Het principe achter een aantal Next GeneraBon Sequencing technieken uitleggen en de voor- en nadelen ten
opzichte van Sanger sequencing benoemen ..................................................................................................... 37
De principes achter site-directed mutagenesis uitleggen en primers hiervoor ontwerpen .............................. 39
Het principe achter CRISPR uitleggen en de toepassingen hiervan in het maken van knock-outs/knock-ins ... 39
Begrippenlijst............................................................................................... Fout! Bladwijzer niet gedefinieerd.
2
,DNA-replica-e & moleculair kloneren
De structuren van DNA en RNA onderscheiden en beschrijven
Elk monomeer in een enkele DNA-streng (elke nucleoBde) bestaat uit drie
delen: een vijf-koolstof suiker (deoxyribose), een fosfaatgroep en een base;
adenine (A), guanine (G), cytosine (C) en thymine (T).
Basenparen: A bindt met T en C bindt met G.
In tegenstelling tot de covalente suiker-fosfaat bindingen van de backbone,
zijn de waterstoRruggen tussen de basenparen zwak, waardoor twee DNA-
strengen van elkaar kunnen worden gescheiden zonder dat de backbone
breekt.
Tussen het basenpaar C en G vormen zich 3 waterstoRruggen en tussen het
basepaar A en T vormen zich 2 waterstoRruggen.
De twee DNA-strengen lopen anBparallel van elkaar. De
nucleoBden worden covalent aan elkaar gebonden door een
fosfaatdiëster binding die het 3’ -hydroxyl (-OH) groep van een
suiker bindt aan de 5’ fosfaat (-PO3).
De uiteinden van de DNA-streng verschillen: een eind heeZ een
fosfaatgroep gebonden aan een 5’ koolstof en het andere eind
heeZ een hydroxyl groep gebonden aan een 3’ koolstof.
RNA is enkelstrengs en heeZ een ribose als suiker, ook is een van
de vier basen anders, namelijk uracil (U) in plaats van thymine (T).
Hetzelfde segment van DNA kan herhaaldelijk worden gebruikt
voor de synthese van vele idenBeke RNA-moleculen.
Uracil, cytosine en thymine zijn
pyrimidines. Adenine en guanine zijn
purines.
De fosfaten zijn gebonden aan het 5e
C atoom van een ribose of een
deoxyribose. De fosfaatgroep zorgt
ervoor dat de nucleoBde negaBef
geladen is.
3
, De PCR-techniek uitleggen en gevolgen van wijzigingen in het protocol uitleggen
PCR is een methode om een specifiek stuk DNA te amplificeren m.b.v. DNA-polymerase. DNA-
polymerase hebben primers nodig, er is alBjd een Forward en Reverse primer.
Primers geven PCR een enorme specificiteit (als ze maar lang genoeg zijn), doordat ze een specifieke
sequenBe hebben die alleen kan binden aan een specifieke DNA-sequenBe.
PCR gebruikt een thermostabiele DNA-polymerase; Taq polymerase, dit is geïsoleerd uit een
hi`ebestendige bacterie. Taq-polymerase werkt het best bij 70 °C.
De reacBemix voor PCR bestaat uit: DNA met target sequenBe, primer paar, Taq polymerase,
voldoende nucleoBden (A, T, C, G, dNTP’s) en reacBebuffer met MgCl2 (dit verhoogt de acBviteit van
DNA-polymerase).
PCR stappen:
I. DenaturaBe: van dubbelstrengs DNA naar enkelstrengs DNA, breken van waterstoRruggen
tussen de basenparen, gebeurt bij 94/95 °C en duurt 30 seconden
II. HybridisaBe (annealing): specifieke primers binden, gebeurt bij 50-60 °C (ahankelijk van de
primer; veel bindingen = hogere temperatuur) en duurt 15-30 seconden. Bij een te lage
annealingtemperatuur worden de primers aspecifiek en binden ze op heel veel plekken.
III. ElongaBe: DNA-polymerase bouwt nieuwe nucleoBde aan en syntheBseert zo een nieuwe
streng DNA. De duur van elongaBe is ahankelijk van de groo`e van het fragment en de
snelheid van de Taq polymerase, de temperatuur is 72 °C.
Primers ontwerpen en de zaken waar rekening mee gehouden moet worden uitleggen
Smel`emperatuur (Tm): Temperatuur waarbij een primer (theoreBsch) loslaat van zijn template. Ligt
bij voorkeur tussen de 55°C en 65°C. Vuistregel: Tm = 4(G + C) + 2(A + T) °C.
Annealingstemperatuur (Ta): Temperatuur waarbij men primers laat hechten aan template à Vaak
~5°C onder de gemiddelde Tm van de primers. Exacte Ta moet empirisch worden bepaald.
Richtlijnen primer ontwerpen:
1. Lengte: 17-28 nucleoBden. Bij langer wordt annealing moeilijker en bij korter heb je minder
specificiteit.
2. GC-gehalte: 50-60%. Hoger is te hoge smel`emperatuur en lager is minder specificiteit.
3. Forward en reverse primers moeten ongeveer dezelfde smel`emperatuur hebben (binnen
5°C).
4. Primers moeten aan 3’ zijde eindigen op G of C à voorkomt loslaten.
5. Niet meer dan drie C’s of G’s aan 3’ uiteinde à primer bindt dan te makkelijk aan (verkeerde)
G of C rijke gebieden in het target DNA.
6. Er mag geen baseparing mogelijk zijn in de primer zelf (self-annealing) of
tussen de twee primers (primer-dimer).
Als de DNA-sequenBe als volgt is:
5’ GCTGAATCGA----------GGGTACCGTA 3’
Dan is de forward primer: GCTGAATCGA
En de reverse primer: TACGGTACCC
4
