Met behulp van DNA-analyse en eiwitanalyse het onbekende
fluorescente eiwit achterhalen:
Yellow Fluorescent Protein
Micha de Ronde en Ibrah Qayoumi
Bouwstenen van het leven
Gezondheid en Leven
11-10-2020
Aantal woorden: 3700
,Abstract
De ontdekking van Green Fluorescent Protein vond plaats begin jaren ‘60 in een onderzoek
naar de Aequorea Victoria-kwal. Zodra er blauw licht op GFP valt, zal deze overgaan tot de
aangeslagen toestand en uiteindelijk terugvallen naar de grondtoestand, dit zal zich uiten in
het uitzenden van groen licht. Dit eiwit heeft als groot voordeel dat het makkelijk toegepast
kan worden als biologische marker in organismen. GFP kan fluoresceren met verschillende
kleuren door modificaties van de secundaire structuur, voorbeelden van mutanten zijn CFP
(cyan fluorescent protein), YFP (yellow fluorescent protein), BFP (blue fluorescent protein) en
RFP (red fluorescent protein). In dit onderzoek werd onderzocht voor welk fluorescerend eiwit
het gen op het plasmide van de verkregen bacterie codeerde en wat de eigenschappen van dit
eiwit zijn. Er waren vier mogelijke Fluorescent Proteins: GFP, CFP, YFP en mCherry (RFP). Er is
onderzoek gedaan op twee niveaus; een analyse op DNA-niveau en een analyse op
eiwitniveau. Door het gebruik van DNA-technieken werd de eerste aanwijzing voor welk
fluorescerend eiwit het gen op het plasmide codeerde verkregen. Aan de hand van de
uitgevoerde eiwit technieken werd vervolgens bevestigd of het vermoeden klopte. Uit de
DNA-analyse is te concluderen dat het bandenpatroon van de gekregen plasmiden
overeenkomt met het bandenpatroon van Yellow Fluorescent Protein (YFP). Met behulp van
agarose gelelektroforese werden de Rf-waardes berekend. Echter kon dit niet voor het
onbekende eiwit, want er was geen duidelijk bandje zichtbaar, waardoor de loopafstand niet
bepaald kon worden. De absorptiepiek zat bij 505 nm, dit was af te lezen uit het
absorptiespectrum. De fluorescentie piek zat bij 530 nm, dit was af te lezen uit het
emissiespectrum. Deze waarden kwamen overeen met de waarden van YFP. De verkregen
resultaten zijn in lijn met elkaar en duiden er allemaal op dat Yellow Fluorescent Protein voor
het gen op het plasmide van de verkregen Escherichia coli-bacterie codeerde.
2
, Inleiding
De ontdekking van Green Fluorescent Protein vond plaats begin jaren ‘60 door Shimomura,
die onderzoek deed naar bepaalde eigenschappen van de Aequorea Victoria-kwal en zo naast
het foto-eiwit: Aequorin, GFP ontdekte, zuiverde en karakteriseerde (1). GFP heeft zoals in
figuur 1 te zien is de vorm van een ton en bestaat uit één enkele peptideketen, waarbij de
chromofoor uit slechts drie aminozuren bestaat die samen het fluorofoor vormen. Dit was een
erg belangrijke bevinding, want er werd vastgesteld dat het chromofoor onderdeel was van de
peptideketen en dus ontstond de mogelijkheid om GFP te klonen. Het mechanisme werkt als
volgt: Aequorin zendt blauw licht uit in de kwal en zodra dit op de chromofoor valt, zal deze
het blauwe licht absorberen en overgaan tot de eerste aangeslagen toestand. Vervolgens zal
het terugvallen naar de grondtoestand en dus groene fluorescentie met een lagere energie
uitzenden (2).
Figuur 1: Molecuul GFP (2)
GFP heeft verschillende toepassingen, de belangrijkste in organismen. Doordat GFP alleen
zuurstof nodig heeft voor de reactie tussen de drie aminozuren in het chromofoor en zuurstof
beschikbaar is in bijna alle levende cellen, kan het toegepast worden als biologische marker.
Door middel van fusie wordt GFP gebonden aan het te onderzoeken cel en vervolgens kunnen
essentiële processen van de cel worden waargenomen zoals celdeling, uitscheiding van
hormonen en cel communicatie. Een groot voordeel is dat GFP overal in het lichaam
waargenomen kan worden, er hoeft alleen UV-licht op te vallen en als reactie daarop zal het
groen licht uitzenden (3).
Aangezien de genetische code en de aminozuur code van GFP welbegrepen is, is deze aan
verschillende wijzigingen onderworpen. GFP werd allereerst gemodificeerd om verbeterde
GFP (enhanced GFP, eGFP) te produceren. Dit gemodificeerde GFP heeft o.a. een verhoogde
fluorescentie-intensiteit, grotere foto stabiliteit en hogere efficiëntie bij kamertemperatuur.
GFP kan fluoresceren met verschillende kleuren door aanpassingen rechtstreeks aan de
chromofoor, de secundaire structuur, waaronder CFP (cyan fluorescent protein), YFP (yellow
fluorescent protein), BFP (blue fluorescent protein) en RFP (red fluorescent protein). Deze
mutanten van GFP zijn allemaal afzonderlijk verbeterd en hebben hun eigen toepassingen.
Tegenwoordig bestaan er hele families van fluorescerende eiwitten, waarvan van allen de
oorsprong bij GFP ligt (4).
3
fluorescente eiwit achterhalen:
Yellow Fluorescent Protein
Micha de Ronde en Ibrah Qayoumi
Bouwstenen van het leven
Gezondheid en Leven
11-10-2020
Aantal woorden: 3700
,Abstract
De ontdekking van Green Fluorescent Protein vond plaats begin jaren ‘60 in een onderzoek
naar de Aequorea Victoria-kwal. Zodra er blauw licht op GFP valt, zal deze overgaan tot de
aangeslagen toestand en uiteindelijk terugvallen naar de grondtoestand, dit zal zich uiten in
het uitzenden van groen licht. Dit eiwit heeft als groot voordeel dat het makkelijk toegepast
kan worden als biologische marker in organismen. GFP kan fluoresceren met verschillende
kleuren door modificaties van de secundaire structuur, voorbeelden van mutanten zijn CFP
(cyan fluorescent protein), YFP (yellow fluorescent protein), BFP (blue fluorescent protein) en
RFP (red fluorescent protein). In dit onderzoek werd onderzocht voor welk fluorescerend eiwit
het gen op het plasmide van de verkregen bacterie codeerde en wat de eigenschappen van dit
eiwit zijn. Er waren vier mogelijke Fluorescent Proteins: GFP, CFP, YFP en mCherry (RFP). Er is
onderzoek gedaan op twee niveaus; een analyse op DNA-niveau en een analyse op
eiwitniveau. Door het gebruik van DNA-technieken werd de eerste aanwijzing voor welk
fluorescerend eiwit het gen op het plasmide codeerde verkregen. Aan de hand van de
uitgevoerde eiwit technieken werd vervolgens bevestigd of het vermoeden klopte. Uit de
DNA-analyse is te concluderen dat het bandenpatroon van de gekregen plasmiden
overeenkomt met het bandenpatroon van Yellow Fluorescent Protein (YFP). Met behulp van
agarose gelelektroforese werden de Rf-waardes berekend. Echter kon dit niet voor het
onbekende eiwit, want er was geen duidelijk bandje zichtbaar, waardoor de loopafstand niet
bepaald kon worden. De absorptiepiek zat bij 505 nm, dit was af te lezen uit het
absorptiespectrum. De fluorescentie piek zat bij 530 nm, dit was af te lezen uit het
emissiespectrum. Deze waarden kwamen overeen met de waarden van YFP. De verkregen
resultaten zijn in lijn met elkaar en duiden er allemaal op dat Yellow Fluorescent Protein voor
het gen op het plasmide van de verkregen Escherichia coli-bacterie codeerde.
2
, Inleiding
De ontdekking van Green Fluorescent Protein vond plaats begin jaren ‘60 door Shimomura,
die onderzoek deed naar bepaalde eigenschappen van de Aequorea Victoria-kwal en zo naast
het foto-eiwit: Aequorin, GFP ontdekte, zuiverde en karakteriseerde (1). GFP heeft zoals in
figuur 1 te zien is de vorm van een ton en bestaat uit één enkele peptideketen, waarbij de
chromofoor uit slechts drie aminozuren bestaat die samen het fluorofoor vormen. Dit was een
erg belangrijke bevinding, want er werd vastgesteld dat het chromofoor onderdeel was van de
peptideketen en dus ontstond de mogelijkheid om GFP te klonen. Het mechanisme werkt als
volgt: Aequorin zendt blauw licht uit in de kwal en zodra dit op de chromofoor valt, zal deze
het blauwe licht absorberen en overgaan tot de eerste aangeslagen toestand. Vervolgens zal
het terugvallen naar de grondtoestand en dus groene fluorescentie met een lagere energie
uitzenden (2).
Figuur 1: Molecuul GFP (2)
GFP heeft verschillende toepassingen, de belangrijkste in organismen. Doordat GFP alleen
zuurstof nodig heeft voor de reactie tussen de drie aminozuren in het chromofoor en zuurstof
beschikbaar is in bijna alle levende cellen, kan het toegepast worden als biologische marker.
Door middel van fusie wordt GFP gebonden aan het te onderzoeken cel en vervolgens kunnen
essentiële processen van de cel worden waargenomen zoals celdeling, uitscheiding van
hormonen en cel communicatie. Een groot voordeel is dat GFP overal in het lichaam
waargenomen kan worden, er hoeft alleen UV-licht op te vallen en als reactie daarop zal het
groen licht uitzenden (3).
Aangezien de genetische code en de aminozuur code van GFP welbegrepen is, is deze aan
verschillende wijzigingen onderworpen. GFP werd allereerst gemodificeerd om verbeterde
GFP (enhanced GFP, eGFP) te produceren. Dit gemodificeerde GFP heeft o.a. een verhoogde
fluorescentie-intensiteit, grotere foto stabiliteit en hogere efficiëntie bij kamertemperatuur.
GFP kan fluoresceren met verschillende kleuren door aanpassingen rechtstreeks aan de
chromofoor, de secundaire structuur, waaronder CFP (cyan fluorescent protein), YFP (yellow
fluorescent protein), BFP (blue fluorescent protein) en RFP (red fluorescent protein). Deze
mutanten van GFP zijn allemaal afzonderlijk verbeterd en hebben hun eigen toepassingen.
Tegenwoordig bestaan er hele families van fluorescerende eiwitten, waarvan van allen de
oorsprong bij GFP ligt (4).
3
