Moleculaire biologie
Thema 1: DNA replicatie & moleculair kloneren
Les 1
In de moleculaire biologie gaat het om mutaties, hoe deze ontstaan, hoe ze aangetoont
kunnen worden en hoe ziekmakende mutaties kunnen worden gevonden.
Bij taaislijmziekte gaat het om een mutatie in het gen dat codeert voor het CFTR eiwit. Het
GFTR eiwit kan kan op verschillende plaatsen een mutatie hebben. De plek van de mutatie
bepaalt wat het voor gevolg heeft. Zo kan een mutatie bijvoorbeeld ook geen effect hebben
op een gen.
DNA is een dubbelstrengse helix die erfelijk materiaal bevat. In deze helix worden basen
gepaard met behulp van waterstofbruggen. De twee strengen lopen antiparallel, zo loopt de
ene streng van ‘3 naar ‘5 en de ander van ‘5 naar ‘3. DNA bestaat uit een koppeling van
nucleotiden. Een nucleotide bestaat uit een fosfaatgroep, een suikergroep en een base. Bij
DNA gaat het om de suikergroep deoxyribose. De basen in DNA zijn Adenine (A), Tyrosine
(T), Guanine (G) en Cytosine (C).
DNA polymerasen zijn enzymen die DNA kunnen synthetiseren met behulp van een
template streng. Deze DNA polymerasen hebben een template streng nodig. Alle DNA
polymerasen hebben een beginstukje nodig, wat een primer wordt genoemd. Zo’n primer
kan bestaan uit RNA of DNA. DNA polymerasen lezen van de ‘3 naar ‘5 kant, ze
synthetiseren dan dus van de ‘5 naar ‘3 kant.
Om bijvoorbeeld genen te kopiëren, kan worden gekloneerd. Dit kloneren bestaat uit een
aantal stappen:
1. Isoleren van genomisch DNA of RNA
2. PCR uitvoeren op het gen waarin je geïnteresseerd bent
3. Digestie van gen en plasmide
4. Ligatie
5. Transformatie
6. Bacteriekweek
7. Plasmide isolatie
8. Validatie
Stap 2 zegt PCR uitvoeren. PCR staat voor Polymerase Chain Reaction, dit is een methode
om een specifiek stuk DNA te multipliceren met behulp van DNA polymerase. Daarvoor is
dus een primer nodig. De code van de primer kun je zelf bepalen en zo kan bepaalt worden
vanaf waar het DNA wordt afgelezen en dus gekopieerd. Een primer kan de PCR erg
specifiek maken.
De polymerase chain reaction bestaat uit 3 stappen:
1. Denaturatie. In deze stap wordt de temperatuur verhoogd waardoor het
dubbelstrengse DNA uiteenvalt in twee enkele strengen. Het gaat hierbij om een
temperatuur van 90-100°C. Deze stap kan ongeveer 30 seconden tot 1 minuut
duren.
2. Annealing. In deze stap wordt de temperatuur verlaagd tot 50-60°C waardoor de
primers kunnen binden aan het DNA. De temperatuur in deze fase hangt af van de
primer. Hoe lager de temperatuur, hoe minder specifiek de binding met van de
primer. Dit betekend bijv. dat de primer kan binden op meerdere plekken waar de
, nucleotidesequentie grotendeels overeenkomt met dat van de primer. Deze stap
heeft een duur van ongeveer 1 minuut, dit hangt daarnaast ook af van hoe lang de
primer is.
3. Elongatie. In deze stap wordt het DNA vanaf de primer aangevuld met behulp van
DNA polymerase. Tijdens de elongatie is er een temperatuur van 72°C. De duur van
deze stap hangt af van de grootte van het stuk DNA wat gekopieerd moet worden.
Als de elongatie te kort duurt, wordt er maar een klein stukje DNA gekopieerd. In de
volgende ronde kan de primer dan niet binden en wordt het DNA dus niet
gekopieerd.
Deze stappen kunnen meerdere keren worden herhaald, afhankelijk van hoe vaak je het
stuk DNA wilt kopiëren.
De reactiemix die bij de PCR wordt gebruikt bestaat uit:
➢ Het DNA met de targetsequentie (het stuk wat je wilt kopiëren)
➢ Twee primers, voor elk stuk één
➢ DNA polymerase
➢ Voldoende nucleotiden, om het DNA aan te vullen
➢ Reactiebuffer, deze bevat magnesium
Bij PCR zijn de primers gemaakt van DNA, RNA gaat namelijk sneller kapot. Zo voorkomen
we dat we de primers kwijtraken en kunnen we ze hergebruiken. Een primer bepaalt waar
DNA polymerase bindt op de template streng. De combinatie van nucleotiden van de primer
bepaald bij welke temperatuur de primer bindt. De smelttemperatuur (Tm) is de temperatuur
waarbij een primer loslaat van zijn template. Deze temperatuur kan worden berekend met de
volgende formule: Tm = 4(G + C) + 2(A + T)°C. Naast de smelttemperatuur is er de
annealingstemperatuur (Ta). Dit is de temperatuur waarbij de primers kunnen hechten aan
de template streng. Deze temperatuur ligt vaak ongeveer 5°C onder de smelttemperatuur.
Er zijn bepaalde richtlijnen voor primers:
➢ Lengte is ongeveer 17-28 nucleotiden. Is de primer langer, dan wordt de annealing
moeilijker. Is de primer korter, dan is de primer minder specifiek.
➢ GC-gehalte: 50-60%. Is dit gehalte hoger, dan zal de smelttemperatuur te hoog zijn.
Is dit gehalte lager, dan is de primer minder specifiek.
➢ Forward en reverse primers moeten ongeveer dezelfde smelttemperatuur hebben.
Dit omdat dan beide primers op hetzelfde moment kunnen hechten en loslaten.
➢ Primers moeten aan de ‘3 zijde eindigen op G or C. G en C hebben 3 H-bruggen en
blijven beter vastzitten. Dit aan de ‘3 zijde omdat DNA polymerase vanaf daar begint
met lezen.
➢ Niet meer dan drie C’s of G’s aan ‘3 uiteinde. Als dit wel het geval is kan de primer
namelijk de makkelijk binden aan verkeerde C of G rijke gebieden in het target DNA.
➢ Er mag geen baseparing mogelijk zijn in de primer zelf (self-annealing) of tussen de
twee primers (primer-dimer).
Les 2
DNA replicatie bestaat uit een aantal stappen, waaronder initiatie. Er zijn een aantal
verschillen tussen de initiatie bij prokaryoten en eukaryoten.
, Initiatie prokaryoten:
DnaA-eiwitten binden in het A-T rijke gebied op het DNA. A-T rijke gebieden
zijn makkelijk open te breken door de stress die ontstaat na het binden van
DnaA. DnaB is een helicase, deze bindt aan DnaA met behulp van DnaC.
DnaC is een helicase loading protein. Deze blokkeert het helicase totdat het
correct is geplaatst op de ORI. Een helicase opent de ORI (ritst het DNA
open). DnaG is een primase welke de RNA primer op het enkelstrengse
DNA plaatst. Bij prokaryoten is de ORI slechts één keer actief per celdeling.
Is deze actief, dan gaat het om volledig gemethyleerde ORI. Bij
hemigemethyleerde (deels gemethyleerd) ORI is de ORI inactief. Pas na
volledige methylering van de A’s in de GATC sequenties door een DNA
methylase, kan de ORI opnieuw gebruikt worden.
Initiatie eukaryoten:
DNA heeft een ORC binding site. Dit is de bindingsplaats voor een origin recognition
complex (ORC). De unwinding region is een sequentie DNA die rijk is aan A-T, deze zijn
namelijk gemakkelijk open te breken. De Abf1 binding site is de bindingsplaats voor eiwitten
die helpen om ORC aan te trekken.
ORC zit gedurende de gehele celcyclus gebonden aan een ORI
(behalve tijdens de replicatie van de origin zelf). Alleen
ongefosforyleerd ORC kan een prereplicatie complex vormen.
Zodra een ORI is geactiveerd, en de replicatievorken van start zijn
gegaan, wordt ORC gefosforyleerd. Defosforylering van ORC
gebeurt pas aan het einde van de mitose.
Helicase verbreekt de H-bruggen tussen de
basen. Hierdoor wordt DNA enkelstrengs en
beschikbaar voor DNA polymerase. Helicases
verbruiken energie in de vorm van ATP. Tijdens
de replicatie loopt helicase over de ‘5 → ‘3 streng
en duwt de andere streng weg.
Restrictie nuclease is een enzym wat het DNA kan knippen op een specifieke
sequentie.
Ligase is een enzym dat twee stukken DNA die op dezelfde manier zijn geknipt, aan elkaar
kan binden.
DNA polymerase is het enzym wat zorgt voor het inbouwen van nucleotiden.
Thema 1: DNA replicatie & moleculair kloneren
Les 1
In de moleculaire biologie gaat het om mutaties, hoe deze ontstaan, hoe ze aangetoont
kunnen worden en hoe ziekmakende mutaties kunnen worden gevonden.
Bij taaislijmziekte gaat het om een mutatie in het gen dat codeert voor het CFTR eiwit. Het
GFTR eiwit kan kan op verschillende plaatsen een mutatie hebben. De plek van de mutatie
bepaalt wat het voor gevolg heeft. Zo kan een mutatie bijvoorbeeld ook geen effect hebben
op een gen.
DNA is een dubbelstrengse helix die erfelijk materiaal bevat. In deze helix worden basen
gepaard met behulp van waterstofbruggen. De twee strengen lopen antiparallel, zo loopt de
ene streng van ‘3 naar ‘5 en de ander van ‘5 naar ‘3. DNA bestaat uit een koppeling van
nucleotiden. Een nucleotide bestaat uit een fosfaatgroep, een suikergroep en een base. Bij
DNA gaat het om de suikergroep deoxyribose. De basen in DNA zijn Adenine (A), Tyrosine
(T), Guanine (G) en Cytosine (C).
DNA polymerasen zijn enzymen die DNA kunnen synthetiseren met behulp van een
template streng. Deze DNA polymerasen hebben een template streng nodig. Alle DNA
polymerasen hebben een beginstukje nodig, wat een primer wordt genoemd. Zo’n primer
kan bestaan uit RNA of DNA. DNA polymerasen lezen van de ‘3 naar ‘5 kant, ze
synthetiseren dan dus van de ‘5 naar ‘3 kant.
Om bijvoorbeeld genen te kopiëren, kan worden gekloneerd. Dit kloneren bestaat uit een
aantal stappen:
1. Isoleren van genomisch DNA of RNA
2. PCR uitvoeren op het gen waarin je geïnteresseerd bent
3. Digestie van gen en plasmide
4. Ligatie
5. Transformatie
6. Bacteriekweek
7. Plasmide isolatie
8. Validatie
Stap 2 zegt PCR uitvoeren. PCR staat voor Polymerase Chain Reaction, dit is een methode
om een specifiek stuk DNA te multipliceren met behulp van DNA polymerase. Daarvoor is
dus een primer nodig. De code van de primer kun je zelf bepalen en zo kan bepaalt worden
vanaf waar het DNA wordt afgelezen en dus gekopieerd. Een primer kan de PCR erg
specifiek maken.
De polymerase chain reaction bestaat uit 3 stappen:
1. Denaturatie. In deze stap wordt de temperatuur verhoogd waardoor het
dubbelstrengse DNA uiteenvalt in twee enkele strengen. Het gaat hierbij om een
temperatuur van 90-100°C. Deze stap kan ongeveer 30 seconden tot 1 minuut
duren.
2. Annealing. In deze stap wordt de temperatuur verlaagd tot 50-60°C waardoor de
primers kunnen binden aan het DNA. De temperatuur in deze fase hangt af van de
primer. Hoe lager de temperatuur, hoe minder specifiek de binding met van de
primer. Dit betekend bijv. dat de primer kan binden op meerdere plekken waar de
, nucleotidesequentie grotendeels overeenkomt met dat van de primer. Deze stap
heeft een duur van ongeveer 1 minuut, dit hangt daarnaast ook af van hoe lang de
primer is.
3. Elongatie. In deze stap wordt het DNA vanaf de primer aangevuld met behulp van
DNA polymerase. Tijdens de elongatie is er een temperatuur van 72°C. De duur van
deze stap hangt af van de grootte van het stuk DNA wat gekopieerd moet worden.
Als de elongatie te kort duurt, wordt er maar een klein stukje DNA gekopieerd. In de
volgende ronde kan de primer dan niet binden en wordt het DNA dus niet
gekopieerd.
Deze stappen kunnen meerdere keren worden herhaald, afhankelijk van hoe vaak je het
stuk DNA wilt kopiëren.
De reactiemix die bij de PCR wordt gebruikt bestaat uit:
➢ Het DNA met de targetsequentie (het stuk wat je wilt kopiëren)
➢ Twee primers, voor elk stuk één
➢ DNA polymerase
➢ Voldoende nucleotiden, om het DNA aan te vullen
➢ Reactiebuffer, deze bevat magnesium
Bij PCR zijn de primers gemaakt van DNA, RNA gaat namelijk sneller kapot. Zo voorkomen
we dat we de primers kwijtraken en kunnen we ze hergebruiken. Een primer bepaalt waar
DNA polymerase bindt op de template streng. De combinatie van nucleotiden van de primer
bepaald bij welke temperatuur de primer bindt. De smelttemperatuur (Tm) is de temperatuur
waarbij een primer loslaat van zijn template. Deze temperatuur kan worden berekend met de
volgende formule: Tm = 4(G + C) + 2(A + T)°C. Naast de smelttemperatuur is er de
annealingstemperatuur (Ta). Dit is de temperatuur waarbij de primers kunnen hechten aan
de template streng. Deze temperatuur ligt vaak ongeveer 5°C onder de smelttemperatuur.
Er zijn bepaalde richtlijnen voor primers:
➢ Lengte is ongeveer 17-28 nucleotiden. Is de primer langer, dan wordt de annealing
moeilijker. Is de primer korter, dan is de primer minder specifiek.
➢ GC-gehalte: 50-60%. Is dit gehalte hoger, dan zal de smelttemperatuur te hoog zijn.
Is dit gehalte lager, dan is de primer minder specifiek.
➢ Forward en reverse primers moeten ongeveer dezelfde smelttemperatuur hebben.
Dit omdat dan beide primers op hetzelfde moment kunnen hechten en loslaten.
➢ Primers moeten aan de ‘3 zijde eindigen op G or C. G en C hebben 3 H-bruggen en
blijven beter vastzitten. Dit aan de ‘3 zijde omdat DNA polymerase vanaf daar begint
met lezen.
➢ Niet meer dan drie C’s of G’s aan ‘3 uiteinde. Als dit wel het geval is kan de primer
namelijk de makkelijk binden aan verkeerde C of G rijke gebieden in het target DNA.
➢ Er mag geen baseparing mogelijk zijn in de primer zelf (self-annealing) of tussen de
twee primers (primer-dimer).
Les 2
DNA replicatie bestaat uit een aantal stappen, waaronder initiatie. Er zijn een aantal
verschillen tussen de initiatie bij prokaryoten en eukaryoten.
, Initiatie prokaryoten:
DnaA-eiwitten binden in het A-T rijke gebied op het DNA. A-T rijke gebieden
zijn makkelijk open te breken door de stress die ontstaat na het binden van
DnaA. DnaB is een helicase, deze bindt aan DnaA met behulp van DnaC.
DnaC is een helicase loading protein. Deze blokkeert het helicase totdat het
correct is geplaatst op de ORI. Een helicase opent de ORI (ritst het DNA
open). DnaG is een primase welke de RNA primer op het enkelstrengse
DNA plaatst. Bij prokaryoten is de ORI slechts één keer actief per celdeling.
Is deze actief, dan gaat het om volledig gemethyleerde ORI. Bij
hemigemethyleerde (deels gemethyleerd) ORI is de ORI inactief. Pas na
volledige methylering van de A’s in de GATC sequenties door een DNA
methylase, kan de ORI opnieuw gebruikt worden.
Initiatie eukaryoten:
DNA heeft een ORC binding site. Dit is de bindingsplaats voor een origin recognition
complex (ORC). De unwinding region is een sequentie DNA die rijk is aan A-T, deze zijn
namelijk gemakkelijk open te breken. De Abf1 binding site is de bindingsplaats voor eiwitten
die helpen om ORC aan te trekken.
ORC zit gedurende de gehele celcyclus gebonden aan een ORI
(behalve tijdens de replicatie van de origin zelf). Alleen
ongefosforyleerd ORC kan een prereplicatie complex vormen.
Zodra een ORI is geactiveerd, en de replicatievorken van start zijn
gegaan, wordt ORC gefosforyleerd. Defosforylering van ORC
gebeurt pas aan het einde van de mitose.
Helicase verbreekt de H-bruggen tussen de
basen. Hierdoor wordt DNA enkelstrengs en
beschikbaar voor DNA polymerase. Helicases
verbruiken energie in de vorm van ATP. Tijdens
de replicatie loopt helicase over de ‘5 → ‘3 streng
en duwt de andere streng weg.
Restrictie nuclease is een enzym wat het DNA kan knippen op een specifieke
sequentie.
Ligase is een enzym dat twee stukken DNA die op dezelfde manier zijn geknipt, aan elkaar
kan binden.
DNA polymerase is het enzym wat zorgt voor het inbouwen van nucleotiden.
