Samenvatting Systeembiologie
Genomic architecture Yeast
Het genoom is het genetisch materiaal van een organisme.
Het genoom van een organisme kan bestaan uit DNA of RNA
(bijv. in RNA-virussen). Het genoom bestaat uit de genen
(coderend DNA), het niet-coderend DNA en de genetische
informatie op plasmiden, zoals de mitochondria en de
chloroplasten. Protisten en planten hebben een relatief groot
genoom in vergelijking met Fungi en zoogdieren.
Saccharomyces cerevisiae (bakkersgist) is een eukaryoot
organisme en heeft een genoom van 12 x 106 basenparen
groot. 16 chromosomen aanwezig. Gist kan voorkomen als
haploïd (n) en diploïd (2n). Haploïde sporen (a en α) kunnen
zich via knopvorming (budding) vegetatief voortplanten
(ongeslachtelijke voortplanting). Daarnaast kunnen
tegenovergestelde sporen met elkaar fuseren. Deze diploïden
kunnen zich vervolgens ook via mitose voortplanten, maar
kunnen ook meiose ondergaan. Hierbij wordt er een ascus
gevormd met 4 sporen: 2x a en 2x α.
Aan de basis van genen liggen open reading frames: een uit
tripletten bestaand DNA-fragment dat overgeschreven en
vertaald kan worden. Deze begint met een startcodon (ATG)
en eindigt met een stopcodon (TAA, TGA, TAG). Deze
transcriptie wordt geregeld door de promotor, waaraan een
RNA-polymerase kan binden. Verschillende ORF’s kunnen
coderen voor verschillende aminozuren en eiwitten op hetzelfde stukje overgeschreven DNA.
Naamgeving S. cerevisiae ORF’s
• Y = yeast
• D = 4e chromosoom, E = 5e chromosoom etc.
• R = rechterarm, L = linkerarm YEL120w
• 130 = 130e ORF vanaf het centromeer
• c = crick strand, w = watson strand YDR130c
➢ mRNA heft een polyA start (stop) en een mRNA cap (start)
1
,Genomes and Genomics
Het genoom kan gesequenced worden via verschillende methoden:
Sequencing type Sanger sequencing Illumina Pacific Nanpore sequen-
sequencing Bioscience cing (MinION)
(PacBio)
Kenmerken - Lange DNA- - DNA- - DNA-sequenties - DNA-sequenties
sequenties van zo’n sequenties van tot 5.000 van 500.000
1.000 nucleotiden 35 tot 250 nucleotiden nucleotiden
- DNA-amplificatie nucleotiden - Geen PCR nodig mogelijk
nodig (bijv. via PCR) - Geen PCR - Enkele moleculen
- in vivo DNA nodig - Geen amplificatie
amplificaties - Veel data - Mobiel
maar korte - Geen PCR nodig
sequenties
Methode - Verhitting van het - DNA vouwt - Adapters toe- - Maken van ssDNA
DNA-fragment voor zich als een voegen aan DNA: met enzym
ssDNA brug en hecht ontstaan van - Spanning over het
- Primer laten aan de chip circulair DNA membraan zetten:
binden aan - Primers - Sequencing met DNA het
template-DNA binden aan het primers, membraan laten
- DNA-polymerase DNA gelabelde dNTP’s passeren
bindt aan primer en - DNA- en DNA- - Sequencing door
voegt dNTP’s en polymerase polymerase spanningsverschil
ddNTP’s toe voegt - Analyse via dat ontstaat door
- Inbouw ddNTP fluoresce- kinetic de DNA-passage
stopt de synthese rende dNTP’s measurements
- Analyse via gel of toe aan primer
capillaire buis - Camera
maakt foto van
de chip en
bepaalt met
een PC welke
base is
ingebouwd
Voorbeeld
gebruik
1 My plasmid with a new GFP-gene fusion
2 I have a genome sequence with 2.000 gaps and want to improve the quality
3 My UV-mutant and the genome of the parental strain is already known
4 A newly isolated fungus
Genome assembly is het in elkaar zetten en schuiven van een genoom of stuk DNA. Via:
• Shotgun sequencing (Sanger): fragmentatie van DNA, klonen van vectoren en sequencing
• Kwaliteit van een genoomsequentie
• Gebruik van computers
2
, Assembly is makkelijker als je veel data hebt.
Shotgun sequencing is een zeer snelle methode om DNA te
assembleren. De uiteinde van de ontstane
sequentiefragmenten, de paired-end reads, zijn erg precies en
bekend. Door overlapping van deze reads kan er een
consensus-DNA worden opgesteld. Door het gebruik van
meerdere DNA-fragmenten is deze methode dus erg precies.
Het aantal reads dat wordt gebruikt bij een assembly wordt de
genome coverage of redundantie genoemd (bijv. 20x). Hoe
hoger de coverage, hoe kleiner de kans op fouten.
Computers kunnen helpen met assembleren. Zij gaan op zoek
naar contigs en scaffolds. Contigs zijn consensus-sequenties die
zijn afgeleid van een groep overlappende sequenties. Scaffolds
zijn groepen contigs samen, maar bevatten daarin nog een ‘gap’
(onbekende sequentie).
Pair end sequencing (Illumina) : je hebt twee uiteinden van een sequence en je weet dat ze bij elkaar
horen → andere delen zo sequencen en overlap bekijken voor geheel plaatje
Short reads assemblies: door een grote coverage worden fouten verminderd, moeilijk om
repeterende sequences te combineren, gebruikt in resequence projecten, The novo assembly vaak
een combinatie van short reads en longer reads sequencing methoden (closing gaps) → Illumina en
Pacific bioscience
Problemen met het assembleren:
• Repetitief DNA (rDNA, transposons, virussen)
➔ Zorgt voor onjuiste overlapping tijdens de assembly
• Niet te kloneren DNA-fragmenten (telomeren, centromeren)
• Het linken van scaffolds aan chromosomen
Structural Genome annotation = het identificeren van genen en hun start-stop- en intron-
exonstructuur
Zoeken naar ORF’s in prokaryoten:
• Start-/stopcodons
• Grootte van het ORF (>300 nt)
• Codon Bias
• Ribosome binding sites (Shine-Dalgarno)
• Homologie met andere organismen
Het is lastiger om deze ORF’s te zoeken in eukaryoten:
• Introns/exons door splicing
• Niet-coderend DNA
• Alternatieve start sites, alternatieve splicing
• MicroORF’s
Verbeteren van structurele annotatie
- mRNA klonen
- RNA-sequencing
3
Genomic architecture Yeast
Het genoom is het genetisch materiaal van een organisme.
Het genoom van een organisme kan bestaan uit DNA of RNA
(bijv. in RNA-virussen). Het genoom bestaat uit de genen
(coderend DNA), het niet-coderend DNA en de genetische
informatie op plasmiden, zoals de mitochondria en de
chloroplasten. Protisten en planten hebben een relatief groot
genoom in vergelijking met Fungi en zoogdieren.
Saccharomyces cerevisiae (bakkersgist) is een eukaryoot
organisme en heeft een genoom van 12 x 106 basenparen
groot. 16 chromosomen aanwezig. Gist kan voorkomen als
haploïd (n) en diploïd (2n). Haploïde sporen (a en α) kunnen
zich via knopvorming (budding) vegetatief voortplanten
(ongeslachtelijke voortplanting). Daarnaast kunnen
tegenovergestelde sporen met elkaar fuseren. Deze diploïden
kunnen zich vervolgens ook via mitose voortplanten, maar
kunnen ook meiose ondergaan. Hierbij wordt er een ascus
gevormd met 4 sporen: 2x a en 2x α.
Aan de basis van genen liggen open reading frames: een uit
tripletten bestaand DNA-fragment dat overgeschreven en
vertaald kan worden. Deze begint met een startcodon (ATG)
en eindigt met een stopcodon (TAA, TGA, TAG). Deze
transcriptie wordt geregeld door de promotor, waaraan een
RNA-polymerase kan binden. Verschillende ORF’s kunnen
coderen voor verschillende aminozuren en eiwitten op hetzelfde stukje overgeschreven DNA.
Naamgeving S. cerevisiae ORF’s
• Y = yeast
• D = 4e chromosoom, E = 5e chromosoom etc.
• R = rechterarm, L = linkerarm YEL120w
• 130 = 130e ORF vanaf het centromeer
• c = crick strand, w = watson strand YDR130c
➢ mRNA heft een polyA start (stop) en een mRNA cap (start)
1
,Genomes and Genomics
Het genoom kan gesequenced worden via verschillende methoden:
Sequencing type Sanger sequencing Illumina Pacific Nanpore sequen-
sequencing Bioscience cing (MinION)
(PacBio)
Kenmerken - Lange DNA- - DNA- - DNA-sequenties - DNA-sequenties
sequenties van zo’n sequenties van tot 5.000 van 500.000
1.000 nucleotiden 35 tot 250 nucleotiden nucleotiden
- DNA-amplificatie nucleotiden - Geen PCR nodig mogelijk
nodig (bijv. via PCR) - Geen PCR - Enkele moleculen
- in vivo DNA nodig - Geen amplificatie
amplificaties - Veel data - Mobiel
maar korte - Geen PCR nodig
sequenties
Methode - Verhitting van het - DNA vouwt - Adapters toe- - Maken van ssDNA
DNA-fragment voor zich als een voegen aan DNA: met enzym
ssDNA brug en hecht ontstaan van - Spanning over het
- Primer laten aan de chip circulair DNA membraan zetten:
binden aan - Primers - Sequencing met DNA het
template-DNA binden aan het primers, membraan laten
- DNA-polymerase DNA gelabelde dNTP’s passeren
bindt aan primer en - DNA- en DNA- - Sequencing door
voegt dNTP’s en polymerase polymerase spanningsverschil
ddNTP’s toe voegt - Analyse via dat ontstaat door
- Inbouw ddNTP fluoresce- kinetic de DNA-passage
stopt de synthese rende dNTP’s measurements
- Analyse via gel of toe aan primer
capillaire buis - Camera
maakt foto van
de chip en
bepaalt met
een PC welke
base is
ingebouwd
Voorbeeld
gebruik
1 My plasmid with a new GFP-gene fusion
2 I have a genome sequence with 2.000 gaps and want to improve the quality
3 My UV-mutant and the genome of the parental strain is already known
4 A newly isolated fungus
Genome assembly is het in elkaar zetten en schuiven van een genoom of stuk DNA. Via:
• Shotgun sequencing (Sanger): fragmentatie van DNA, klonen van vectoren en sequencing
• Kwaliteit van een genoomsequentie
• Gebruik van computers
2
, Assembly is makkelijker als je veel data hebt.
Shotgun sequencing is een zeer snelle methode om DNA te
assembleren. De uiteinde van de ontstane
sequentiefragmenten, de paired-end reads, zijn erg precies en
bekend. Door overlapping van deze reads kan er een
consensus-DNA worden opgesteld. Door het gebruik van
meerdere DNA-fragmenten is deze methode dus erg precies.
Het aantal reads dat wordt gebruikt bij een assembly wordt de
genome coverage of redundantie genoemd (bijv. 20x). Hoe
hoger de coverage, hoe kleiner de kans op fouten.
Computers kunnen helpen met assembleren. Zij gaan op zoek
naar contigs en scaffolds. Contigs zijn consensus-sequenties die
zijn afgeleid van een groep overlappende sequenties. Scaffolds
zijn groepen contigs samen, maar bevatten daarin nog een ‘gap’
(onbekende sequentie).
Pair end sequencing (Illumina) : je hebt twee uiteinden van een sequence en je weet dat ze bij elkaar
horen → andere delen zo sequencen en overlap bekijken voor geheel plaatje
Short reads assemblies: door een grote coverage worden fouten verminderd, moeilijk om
repeterende sequences te combineren, gebruikt in resequence projecten, The novo assembly vaak
een combinatie van short reads en longer reads sequencing methoden (closing gaps) → Illumina en
Pacific bioscience
Problemen met het assembleren:
• Repetitief DNA (rDNA, transposons, virussen)
➔ Zorgt voor onjuiste overlapping tijdens de assembly
• Niet te kloneren DNA-fragmenten (telomeren, centromeren)
• Het linken van scaffolds aan chromosomen
Structural Genome annotation = het identificeren van genen en hun start-stop- en intron-
exonstructuur
Zoeken naar ORF’s in prokaryoten:
• Start-/stopcodons
• Grootte van het ORF (>300 nt)
• Codon Bias
• Ribosome binding sites (Shine-Dalgarno)
• Homologie met andere organismen
Het is lastiger om deze ORF’s te zoeken in eukaryoten:
• Introns/exons door splicing
• Niet-coderend DNA
• Alternatieve start sites, alternatieve splicing
• MicroORF’s
Verbeteren van structurele annotatie
- mRNA klonen
- RNA-sequencing
3
