Samenvatting - Practicum moleculaire biologie (PMOB) (Life Science)

Leerdocument PMOB
De theoretische achtergronden van de gebruikte technieken beschrijven. De kennis hierover vind
je in de protocollen, de introductie van de lessen en de opdrachten van de lessen.
Glucocorticoïden
Steroïde hormonen: Bijv corticosol, androgenen, oestrogenen
Beïnvloeden: metabolisme, ontwikkeling, voortplanting
Effect op glucosehuishouding
Geproduceerd door bijnierschors (cortex)
In lever gluconeogenese: hogere bloedsuikerspiegel, eiwit en vet metabolisme, stress:
verminderen calciumabsorptie door osteoblasten, ontstekingsremmend.
Ontstekingsremmend: verminderen capillaire permeabiliteit(vocht), verminderde migratie witte
bloedcellen, verlaging T-lymfocyten delen, remmen interleukines
Glucocorticoïden en ontstekingen
Remmen chronische onstekingen RA, transplantaties, astma
Glucocorticoïde receptor:
Activatie steroïde receptoren.
Nucleaire receptoren: transcriptie factor, afhankelijk
aanwezigheid hormonen
Selectief voor bepaalde hormonen: GR
receptorglucocorticoïden hormonen
Inactief: cytosol
Na binding: conformatieveranderingnaar celkern
Celkern: reguleert GR expressie van doelwitgenen
(verhoging/verlaging)
Beïnvloed doordat GR bindt aan GRE’s die in promotorgebieden
van deze genen bevinden.
Na binding GRE interactie met coactivatoren die chromatine
structuur beïnvloed en basale trancriptiemachinerie
rekruteren(oproepen)
Consensus(overeenkomst) GRE seq waar GR aan bindt is
GGTACAnnnTGTTCT (“n” staat voor nucleotide; op die positie
maakt het niet uit welk nucleotide er zich bevindt).
Naast deze transcriptiefactor kan de GR ook genexpressie reguleren zonder aan DNA te binden
door bv eiwit-eiwit interacties.
Longweefsel rat gebruikt om cDNA te isoleren.
80-85% rRNA, klein deel mRNA
GR receptoren domeinen
Transactivatiedomein: direct betrokken bij regulatie promoteractiviteittranscriptie
doelwitgenen
DNA-bindend domein: receptor bindt aan specifieke DNA seq (GRE)
Ligand-bindend domein: specifiek binden van liganden (Bij GR zijn dat glucocorticoïden)
(in frame) kloneren
Het ORF in het PCR product begint bij het startcodon van de GR en loopt helemaal door tot het
eind van het PCR product (het stopcodon is namelijk verwijderd, die is niet aanwezig in het PCR
product). Het in frame kloneren lukt alleen als in het PCR product het GR reading frame in de
SacII site hetzelfde is als het GFP reading frame in de SacII site van het plasmide.

, XhoI START
5’ ACTATTCTCGAGGCCACC ATG GAC TCC AAA GAA TCC TTA GC……> 3’
3’TGATAAGAGCTCCGGTGG TAC CTG AGG TTT CTT AGG AAT CG……> 5’
SacII
5’<……GA AAT ATC AAA AAG CTT CTG TTT CAT CAA CCG CGG AAT AGT 3’
3’<……CT TTA TAG TTT TTC GAA GAC AAA GTA GTT GGC GCC TTA TCA 5’




Knippen met de restrictie enzymen levert sticky ends op, zowel bij het PCR product als het
plasmide.
PCR product
XhoI START SacII
5’ ACTATTCTCGAGGCCACC ATG GAC … … … CAT CAA CCG CGG AAT AGT 3’
3’TGATAAGAGCTCCGGTGG TAC CTG … … … GTA GTT GGC GCC TTA TCA 5’

PCR product knippen
XhoI START SacII
5’ TCGAGGCCACC ATG GAC … … … CAT CAA CCG C 3’
3’ CCGGTGG TAC CTG … … … GTA GTT GG 5’

Plasmide
XhoI SacII START GFP
GAT CTC GAG CTC....ACG GTA CCG CGG GCC CGG GAT CCA CCG GTC GCC ACC ATG GTG
CTA GAG CTC GAG....TGC CAT GGC GCC CGG GCC CAG CGG TGG TAC CAC TGG TAC CAC
Plasmide knippen
XhoI SacII START GFP
GAT C GG GCC CGG GAT CCA CCG GTC GCC ACC ATG GTG
CTA GAG CT C GCC CGG GCC CAG CGG TGG TAC CAC TGG TAC CAC

Na ligatie zijn de restrictiesites hersteld (zowel gezien vanuit het PCR product als vanuit het
plasmide). Het reading frame dat begint bij het startcodon van de GR loopt op de juiste manier
door in het reading frame van GFP.
XhoI Kozak Start GR SacII Start GFP
TCAGATCTCGAGGCCACC ATG GAC … CAT CAA CCG CGG GCC CGG … GTC GCC ACC ATG GTG
AGTCTAGAGCTCCGGTGG TAC CTG … GTA GTT GGC GCC CGG GCC … CAG CGG TGG TAC CAC