Tutor weektaak 4 – Klonering strategieën
Regulatie van expressie van IDH1
In deze onderzoekslijn zal er een studie naar de promotor van de IDH genen worden gedaan om de
regulatie van de expressie van dit gen verder op te helderen. Hiervoor wordt de promotor van het
gen aan een reporter gen gefuseerd. De promotorsequentie is echter niet uit een cDNA bank te
verkrijgen (waarom niet?), maar moet uit een genomische bank (of library) gehaald worden. Voor
deze banken worden voornamelijk BAC of YAC vectoren gebruikt.
1. Welk uitgangsmateriaal heb je nodig, RNA (om cDNA van te maken) of DNA?
DNA is nodig, dit omdat er onderzoek gedaan wordt naar de promotorsequentie en de
regulatie van de expressie van het gen. RNA en cDNA zijn hier niet nuttig voor omdat deze
alleen het coderende deel voor het eiwit bevat.
DNA sequentie van IDH promotor deze sequentie voor een reporter zetten regulatie
expressie IDH1 gen achterhalen, doordat nu een ander gen wordt geproduceerd waarvan
achterhaald kan worden wanneer hij tot expressie komt:
Gennaam Genproduct Eigenschap
LacZ β-galactosidasegalactosidase enzym of histochemisch (geeft blauwkleuring)
gusA β-galactosidaseGlucuronidase afkomstig uit Escherichia coli, geeft met X-galactosidaseGluc
blauwkleuring
cat Chloramphenicol Chloramphenicol resistent
acetyltransferase
neo Neomycine G418 resistent
fosfotransferase
gfp Groen fluorescent proteïne afkomstig uit Aequorea victoria, geeft fluorescentie
phoA Alkalische fosfatase (AP) afkomstig uit Escherichia coli, geeft defosforylering
Luciferase- Luciferase afkomstig uit Photinus pyralis en Renilla reniformis,
gen geeft bioluminescentie
2. Uit welk cellen zou je dit kunnen isoleren?
Uit eukaryoten cellen (humaan) of uit de BAC of YAC-vector als het gen hier al in is gezet. De
promotor sequentie zit in een BAC of YAC-vector, omdat de sequentie best groot is (zie de
sequentie van de IDH-promotor hieronder). BAC en YAV-vectoren kunnen veel bp als insert
opnemen.
3. Welk fragment van het cDNA/DNA ga je amplificeren met PCR?
Met PCR wordt de reporter geamplificeerd, die achter de IDH1 promotor zit, zodat de
expressie van het IDH1 gen achterhaald kan worden.
4. Hoe ga je dit vervolgens in een vector ligeren? En in welke vector?
Luciferase vector, zodat de expressie van het IDH1 gen achterhaald kan worden.
EGFP-vector zodat snel duidelijk is hoeveel regulatie er is van het gen.
Regulatie van expressie van IDH1
In deze onderzoekslijn zal er een studie naar de promotor van de IDH genen worden gedaan om de
regulatie van de expressie van dit gen verder op te helderen. Hiervoor wordt de promotor van het
gen aan een reporter gen gefuseerd. De promotorsequentie is echter niet uit een cDNA bank te
verkrijgen (waarom niet?), maar moet uit een genomische bank (of library) gehaald worden. Voor
deze banken worden voornamelijk BAC of YAC vectoren gebruikt.
1. Welk uitgangsmateriaal heb je nodig, RNA (om cDNA van te maken) of DNA?
DNA is nodig, dit omdat er onderzoek gedaan wordt naar de promotorsequentie en de
regulatie van de expressie van het gen. RNA en cDNA zijn hier niet nuttig voor omdat deze
alleen het coderende deel voor het eiwit bevat.
DNA sequentie van IDH promotor deze sequentie voor een reporter zetten regulatie
expressie IDH1 gen achterhalen, doordat nu een ander gen wordt geproduceerd waarvan
achterhaald kan worden wanneer hij tot expressie komt:
Gennaam Genproduct Eigenschap
LacZ β-galactosidasegalactosidase enzym of histochemisch (geeft blauwkleuring)
gusA β-galactosidaseGlucuronidase afkomstig uit Escherichia coli, geeft met X-galactosidaseGluc
blauwkleuring
cat Chloramphenicol Chloramphenicol resistent
acetyltransferase
neo Neomycine G418 resistent
fosfotransferase
gfp Groen fluorescent proteïne afkomstig uit Aequorea victoria, geeft fluorescentie
phoA Alkalische fosfatase (AP) afkomstig uit Escherichia coli, geeft defosforylering
Luciferase- Luciferase afkomstig uit Photinus pyralis en Renilla reniformis,
gen geeft bioluminescentie
2. Uit welk cellen zou je dit kunnen isoleren?
Uit eukaryoten cellen (humaan) of uit de BAC of YAC-vector als het gen hier al in is gezet. De
promotor sequentie zit in een BAC of YAC-vector, omdat de sequentie best groot is (zie de
sequentie van de IDH-promotor hieronder). BAC en YAV-vectoren kunnen veel bp als insert
opnemen.
3. Welk fragment van het cDNA/DNA ga je amplificeren met PCR?
Met PCR wordt de reporter geamplificeerd, die achter de IDH1 promotor zit, zodat de
expressie van het IDH1 gen achterhaald kan worden.
4. Hoe ga je dit vervolgens in een vector ligeren? En in welke vector?
Luciferase vector, zodat de expressie van het IDH1 gen achterhaald kan worden.
EGFP-vector zodat snel duidelijk is hoeveel regulatie er is van het gen.
