Naam: Miranda Seegers en Anne van der Woude
Datum uitvoering: 5 en 12 september 2018
Datum verslag: 14 september 2018
Docent: Trusanne Bos
Reductie van Ethylacetoacetaat en
immobilisatie van β-galactosidasegalactosidase
Samenvatting
Het doel van dit experiment was (S)-(+)-Ethyl 3-Hydroxybutanoaat enzymatisch te synthetiseren uit
ethylacetoacetaat met behulp van een bakkersgist. Na de synthese is het product gezuiverd met
behulp van centrifuge, gevolgd door het toevoegen van een NaCl oplossing waarna het product
geëxtraheerd is met MTBE. MTBE werd verwijderd door de rotavap en tot slot nog gezuiverd met
behulp van een vacuümdestillatie. Het product is karakteriseert met IR (infrarood) en optische
rotatie, ook is de opbrengst bepaald.
Tevens is er ook een experiment gedaan met lactose en de immobilisatie van de β-galactosidase. De
β-galactosidase werd eerst geïmmobiliseerd door dit op te lossen in Na-alginaat oplossing en toe te
druppelen aan 2M CaCl2 zodat er beads ontstonden. De beads zijn aan de lactose oplossing
toegevoegd en de omzetting van lactose in glucose werd bijgehouden met behulp van een
glucosemeter.
Doel
Het doel van dit experiment is het reduceren van ethylacetoacetaat met behulp van gistcellen en het
omzetten van lactose in glucose met behulp van geïmmobiliseerd B-galactosidase.
Inleiding
Reductie
Bij de reductie van ethylacetoacetaat kunnen er twee structuren ontstaan namelijk S en R ethyl 3-
hydroxybutanoaat. Het enzym in de gistel heeft de voorkeur bij de reductie om (S)-(+)-Ethyl 3-
Hydroxybutanoaat te maken. Als deze reductie gedaan zou worden zonder enzym zou er een
racemisch mengsel ontstaan van R en S Ethyl 3-Hydroxybutanoaat.
Immobilisatie
Het gebruik van melkproducten is een belangrijk onderdeel van een volwaardige voeding. Ongeveer
70 tot 80% van de volwassen wereldbevolking beschikt echter over een te lage β-galactosidase-
activiteit in de darmwand en is lactose-intolerant. Bij lactose-intolerantie wordt lactose niet of
onvoldoende afgebroken waardoor het melksuiker begint te gisten in de darmen, wat leidt tot onder
andere krampen, gasvorming, buikloop en een opgeblazen gevoel.
β-galactosidase wordt commercieel aangemaakt uit allerhande bronnen en industrieel gebruikt voor
de productie van lactosevrije melkproducten. Immobilisatie van het enzym is hierbij een interessante
technologie in de zuivelindustrie.
Recent werd een techniek geoptimaliseerd waarbij β-galactosidase afkomstig van Bacillus
stearothermophilus werd gebonden op chitosan met behulp van Tris(hydroxymethyl)-fosfine (THF)
(Chen et al., 2009). Haider & Husain (2009) ontwikkelden een andere, relatief eenvoudige methode
voor de immobilisatie van β-galactosidase afkomstig van Aspergillus oryzae op het oppervlak van Ca-
, alginaat-zetmeel-beads. 1 Immobilisatie van β-galactoside heeft als voordeel dat het enzym makkelijk
terug te winnen is nadat een reactie is voltooid.
Materiaal en methode
Methode (S)-(+)-Ethyl 3-Hydroxybutanoaat
Eerst is de opstelling gebouwd, zie figuur 1. Vervolgens is er 160 mL kraanwater
toegevoegd aan de 1L erlenmeyer. Daarna 29,97 g sucrose en 20,06 g bakkersgist
onder constant roeren. Nadat dit werd toegevoegd werd de thermometer in het
mengsel gehangen. De temperatuur op de verwarmingsplaat werd verhoogd naar
75°C zodat het reactiemengsel snel de gewenste temperatuur van 30°C bereikte.
Toen de gewenste temperatuur bereikt was, werd het mengsel een uur geroerd
op 30 °C. Tijdens het uur roeren ontstond er een schuimlaag die zich steeds
verder uitbreidde. Na dit uur werd er 2,14 g ethylacetoacetaat toegevoegd onder
constant roeren en 30°C. Vervolgens werd er na 1,5 uur nog een keer 2,05 g Figuur 1: Opstelling (S)-(+)-Ethyl
ethylacetoacetaat toegevoegd aan het mengsel. Dit mengsel heeft een week 3-Hydroxybutanoate
gestaan.
Toen het experiment werd vervolgd is er een monster genomen van het reactiemengsel zodat er een
DLC gemaakt kon worden. Vervolgens is het reactiemengsel verdeeld over vier falconbuizen, die na
precies afwegen, geplaatst zijn in de centrifuge. De centrifuge heeft op 4000rpm gedraaid voor 10
minuten. Na de 10 minuten werd het gele, heldere supernatant verzameld in een groot bekerglas.
Aan het bekerglas werd 20 mL van een verzadigde NaCl oplossing
toegevoegd, zodat alle gistcellen gedood werden. Vervolgens werd het
mengsel vijf keer gewassen met 50 mL MTBE. De organische laag was wit
met (zout)korrels en de waterige laag was helder geel. De verschillende
lagen werden in verschillende bekerglazen opgevangen en aan de
organische laag werd magnesiumsulfaat toegevoegd. Er werd net zoveel
magnesiumsulfaat toegevoegd totdat er geen bellen meer ontstonden in
de organische laag. Dit mengsel werd gefiltreerd en vervolgens werd het
filtraat aan de rotavap bevestigd. Het waterbad was 40 graden celsius en
de druk was 329 bar. Nadat alle MTBE was afgedampt werd de opstelling
gebouwd, zie figuur 2. Vervolgens werd het mengsel aan de driehalskolf
bevestigd en werden er kooksteentjes toegevoegd. De verwarmingsplaat
Figuur 2: opstelling vacuümdestillatie
werd ingesteld op 80 graden celsius en de druk bedroeg 450 bar toen er
enige druppels vormden. De opbrengst is bepaald, een IR is gemeten en de optische rotatie is
bepaald.
Datum uitvoering: 5 en 12 september 2018
Datum verslag: 14 september 2018
Docent: Trusanne Bos
Reductie van Ethylacetoacetaat en
immobilisatie van β-galactosidasegalactosidase
Samenvatting
Het doel van dit experiment was (S)-(+)-Ethyl 3-Hydroxybutanoaat enzymatisch te synthetiseren uit
ethylacetoacetaat met behulp van een bakkersgist. Na de synthese is het product gezuiverd met
behulp van centrifuge, gevolgd door het toevoegen van een NaCl oplossing waarna het product
geëxtraheerd is met MTBE. MTBE werd verwijderd door de rotavap en tot slot nog gezuiverd met
behulp van een vacuümdestillatie. Het product is karakteriseert met IR (infrarood) en optische
rotatie, ook is de opbrengst bepaald.
Tevens is er ook een experiment gedaan met lactose en de immobilisatie van de β-galactosidase. De
β-galactosidase werd eerst geïmmobiliseerd door dit op te lossen in Na-alginaat oplossing en toe te
druppelen aan 2M CaCl2 zodat er beads ontstonden. De beads zijn aan de lactose oplossing
toegevoegd en de omzetting van lactose in glucose werd bijgehouden met behulp van een
glucosemeter.
Doel
Het doel van dit experiment is het reduceren van ethylacetoacetaat met behulp van gistcellen en het
omzetten van lactose in glucose met behulp van geïmmobiliseerd B-galactosidase.
Inleiding
Reductie
Bij de reductie van ethylacetoacetaat kunnen er twee structuren ontstaan namelijk S en R ethyl 3-
hydroxybutanoaat. Het enzym in de gistel heeft de voorkeur bij de reductie om (S)-(+)-Ethyl 3-
Hydroxybutanoaat te maken. Als deze reductie gedaan zou worden zonder enzym zou er een
racemisch mengsel ontstaan van R en S Ethyl 3-Hydroxybutanoaat.
Immobilisatie
Het gebruik van melkproducten is een belangrijk onderdeel van een volwaardige voeding. Ongeveer
70 tot 80% van de volwassen wereldbevolking beschikt echter over een te lage β-galactosidase-
activiteit in de darmwand en is lactose-intolerant. Bij lactose-intolerantie wordt lactose niet of
onvoldoende afgebroken waardoor het melksuiker begint te gisten in de darmen, wat leidt tot onder
andere krampen, gasvorming, buikloop en een opgeblazen gevoel.
β-galactosidase wordt commercieel aangemaakt uit allerhande bronnen en industrieel gebruikt voor
de productie van lactosevrije melkproducten. Immobilisatie van het enzym is hierbij een interessante
technologie in de zuivelindustrie.
Recent werd een techniek geoptimaliseerd waarbij β-galactosidase afkomstig van Bacillus
stearothermophilus werd gebonden op chitosan met behulp van Tris(hydroxymethyl)-fosfine (THF)
(Chen et al., 2009). Haider & Husain (2009) ontwikkelden een andere, relatief eenvoudige methode
voor de immobilisatie van β-galactosidase afkomstig van Aspergillus oryzae op het oppervlak van Ca-
, alginaat-zetmeel-beads. 1 Immobilisatie van β-galactoside heeft als voordeel dat het enzym makkelijk
terug te winnen is nadat een reactie is voltooid.
Materiaal en methode
Methode (S)-(+)-Ethyl 3-Hydroxybutanoaat
Eerst is de opstelling gebouwd, zie figuur 1. Vervolgens is er 160 mL kraanwater
toegevoegd aan de 1L erlenmeyer. Daarna 29,97 g sucrose en 20,06 g bakkersgist
onder constant roeren. Nadat dit werd toegevoegd werd de thermometer in het
mengsel gehangen. De temperatuur op de verwarmingsplaat werd verhoogd naar
75°C zodat het reactiemengsel snel de gewenste temperatuur van 30°C bereikte.
Toen de gewenste temperatuur bereikt was, werd het mengsel een uur geroerd
op 30 °C. Tijdens het uur roeren ontstond er een schuimlaag die zich steeds
verder uitbreidde. Na dit uur werd er 2,14 g ethylacetoacetaat toegevoegd onder
constant roeren en 30°C. Vervolgens werd er na 1,5 uur nog een keer 2,05 g Figuur 1: Opstelling (S)-(+)-Ethyl
ethylacetoacetaat toegevoegd aan het mengsel. Dit mengsel heeft een week 3-Hydroxybutanoate
gestaan.
Toen het experiment werd vervolgd is er een monster genomen van het reactiemengsel zodat er een
DLC gemaakt kon worden. Vervolgens is het reactiemengsel verdeeld over vier falconbuizen, die na
precies afwegen, geplaatst zijn in de centrifuge. De centrifuge heeft op 4000rpm gedraaid voor 10
minuten. Na de 10 minuten werd het gele, heldere supernatant verzameld in een groot bekerglas.
Aan het bekerglas werd 20 mL van een verzadigde NaCl oplossing
toegevoegd, zodat alle gistcellen gedood werden. Vervolgens werd het
mengsel vijf keer gewassen met 50 mL MTBE. De organische laag was wit
met (zout)korrels en de waterige laag was helder geel. De verschillende
lagen werden in verschillende bekerglazen opgevangen en aan de
organische laag werd magnesiumsulfaat toegevoegd. Er werd net zoveel
magnesiumsulfaat toegevoegd totdat er geen bellen meer ontstonden in
de organische laag. Dit mengsel werd gefiltreerd en vervolgens werd het
filtraat aan de rotavap bevestigd. Het waterbad was 40 graden celsius en
de druk was 329 bar. Nadat alle MTBE was afgedampt werd de opstelling
gebouwd, zie figuur 2. Vervolgens werd het mengsel aan de driehalskolf
bevestigd en werden er kooksteentjes toegevoegd. De verwarmingsplaat
Figuur 2: opstelling vacuümdestillatie
werd ingesteld op 80 graden celsius en de druk bedroeg 450 bar toen er
enige druppels vormden. De opbrengst is bepaald, een IR is gemeten en de optische rotatie is
bepaald.
