Samenvatting onderdeel
Delputte Immunologie en
immunopathologie
Flow cytometrie
Dot plot
- Cellen door een toestel brengen en parameters meten.
- Dotplot: Iedere cel die geanalyseerd wordt in het bloed, wordt een puntje in de plot. De
waarden van de Y-as bepaald door licht.
- Met zichtbaar licht grootte en granulariteit van de cel bepalen, met fluorescentie kijken
naar de antistoffen die toegevoegd worden aan de celpopulatie.
- Met fluorescentie kunnen CD-merkers geïdentificeerd worden
- Naar 2 parameters kijken: grootte en granuliteit
Histogram
- Altijd een negatieve controle door het toevoegen van een aspecifieke antistof en kijken welke
daar binding mee heeft (onder de blauwe piek).
- Naar 1 parameter kijken: aantal cellen met bepaalde waarde
Werking
- Lichtbron om de fluororen te activeren, dan detecteren welke energie/licht de cel uitstraalt
- Cellen uit de suspensie worden opgezogen, eerst in een brede buis, dan kleine buis zodat
alle cellen na elkaar in een single flow komen
- Met vloeistof de stroom verdunnen zodat alle cellen meebewegen in de buis
- Meerdere lichtbronnen, zichtbaar licht, maar ook lasers die fluorochromen
kunnen activeren. Ook een aantal detectoren voor de verschillende vormen
van licht.
- Antistoffen met verschillende merkers toevoegen, verschillende
fluorochromen per oppervlaktemerker. Met
multicolorflow cytometrie tot 50 fluorochromen
tegelijkertijd meten.
- Forward scatter: als je een cel bestraald met licht en die komt voorbij,
afhankelijk van de densiteit en grootte van de cel gaat de lichtintensiteit
verminderen, dat meet de detector. Detector meet de reductie in
lichtintensiteit afhankelijk van densiteit en grootte van de cel.
- Side scatter: je meet licht dat verstrooid wordt loodrecht op de lichtbron. Bij geen
verstrooiing, geen cel. Bij neutrofielen veel lichtverstrooiing als je granules hebt.
Granules, kern, vorm ER en golgi zorgen voor verstrooiing.
Multi parametrische dotplot
- Forward scatter voor grootte, side scatter voor granules.
- Rechtsboven granulocyten: grote cellen met veel granules, hoge interne complexiteit. Hoge
voorwaartse en zijwaartse verstrooiing.
- Midden: gemengde populatie, meeste immuuncellen. Leucocyten, monocyten en
macrofagen. Kleine tot middelgrote cellen met lage interne complexiteit/granulariteit.
Medium forward-scatter en lage side-scatter signaalintensiteit.
- D: Debrie, kapotte cellen. Zeer kleine voorwerpen met lage voorwaartse en zijwaartse
verstrooiing.
, - Na vaccinatie of infectie treedt er een verschuiving op van cellen met een
bepaalde merker. Prostimulatorische cellen die hoog tot expressie komen bij
een gevaarsignaal
Immunologische kleuringen
- Links klassieke populatie door flow cytometrie met side en forward scatter
- Rechts het resultaat van CD4 en CD8 kleuring
- De puntjes links en rechts zijn dezelfde cellen, maar krijgen een andere plaats.
We weten niet welk puntje in de linkse figuur, waar in de rechtse figuur zit.
- Bij gating ofwel regio’s bepalen dan rond een bepaalde populatie een
lijn trekken. Dan in andere plots ook duidelijk als rode puntjes.
Immuniteit tegenover virussen
- Immuunsysteem herkent dat er lichaamsvreemde stoffen aanwezig zijn door
patroonherkenningsreceptoren, die herkennen of er een bacterie of virus aanwezig is.
- Bij bacteriën een arsenaal aan receptoren voor bacteriële factoren, bij virussen moeilijker te zien, de
cellen maken dan zelf virale eiwitten aan.
- Patroonherkenningsreceptoren van het aangeboren immuunsysteem zijn niet geschikt om eigen
eiwitten aan te maken, herkenning door aangeboren immuunsysteem heel moeilijk.
- Kijken naar zaken die normaal niet te zien zijn in een normale cel. Bacteriële
celwand heeft veel verschillende suikers en zaken die het eigen lichaam niet
heeft. Viraal eiwit moeilijk of niet te herkennen.
- Uniek voor virussen: Bij RNA-virussen dubbelstrengig RNA aangemaakt als
intermediair tijdens de replicatie, dat is een sterke trigger om interferon-alfa te
induceren
- Bij DNA-virussen is viraal RNA anders aangepast, dat gaat het immuunsysteem
herkennen. Sterke reactie op intermediaire componenten van het genoom die
vermeerderd worden in de cel.
- Patronen bij virussen op het moment dat capsid gemaakt wordt, meestal een
herhaling van een aantal eiwitten die continu voorkomen in een bepaalde orde,
dat kan herkend worden tijdens de replicatie.
Innate/aangeboren immuniteit: patroonherkenningsreceptoren antivirale sensoren
- Virussen bevatten geen gemakkelijk herkenbare microbe-specifieke structuren, zijn opgebouwd uit
host afgeleide componenten.
- Twee complementaire receptorsystemen herkennen virale nucleïnezuren
o Nucleïnezuursensoreiwitten die in het cytosol van alle kernhoudende cellen worden
aangetroffen. RIG-1 en MDA5 detecteren viraal dsRNA geproduceerd door virale infectie,
signaleren vervolgens via adaptereiwitten om IFN-β-gen te activeren
o TOLL-Like receptoren: TLR3 herkent dsRNA. TLR7 en TLR8 herkennen enkelstrengs RNA-
virussen zoals vesiculaire stomatitis en influenzavirussen. TLR9 detecteert ongemethyleerde
CpG-motieven in DNA
Aangeboren immuniteit: interferonen
- Interferonen zijn cytokinen die andere cellen beschermen tegen virale invasie, zijn glycoproteïnen
- Ze beschermen de cel die geïnfecteerd is, maar ook naburige cellen tegen infectie.
- Bestaan uit drie grote types, 1, 2 en 3, de meeste komen voor bij type-1
Delputte Immunologie en
immunopathologie
Flow cytometrie
Dot plot
- Cellen door een toestel brengen en parameters meten.
- Dotplot: Iedere cel die geanalyseerd wordt in het bloed, wordt een puntje in de plot. De
waarden van de Y-as bepaald door licht.
- Met zichtbaar licht grootte en granulariteit van de cel bepalen, met fluorescentie kijken
naar de antistoffen die toegevoegd worden aan de celpopulatie.
- Met fluorescentie kunnen CD-merkers geïdentificeerd worden
- Naar 2 parameters kijken: grootte en granuliteit
Histogram
- Altijd een negatieve controle door het toevoegen van een aspecifieke antistof en kijken welke
daar binding mee heeft (onder de blauwe piek).
- Naar 1 parameter kijken: aantal cellen met bepaalde waarde
Werking
- Lichtbron om de fluororen te activeren, dan detecteren welke energie/licht de cel uitstraalt
- Cellen uit de suspensie worden opgezogen, eerst in een brede buis, dan kleine buis zodat
alle cellen na elkaar in een single flow komen
- Met vloeistof de stroom verdunnen zodat alle cellen meebewegen in de buis
- Meerdere lichtbronnen, zichtbaar licht, maar ook lasers die fluorochromen
kunnen activeren. Ook een aantal detectoren voor de verschillende vormen
van licht.
- Antistoffen met verschillende merkers toevoegen, verschillende
fluorochromen per oppervlaktemerker. Met
multicolorflow cytometrie tot 50 fluorochromen
tegelijkertijd meten.
- Forward scatter: als je een cel bestraald met licht en die komt voorbij,
afhankelijk van de densiteit en grootte van de cel gaat de lichtintensiteit
verminderen, dat meet de detector. Detector meet de reductie in
lichtintensiteit afhankelijk van densiteit en grootte van de cel.
- Side scatter: je meet licht dat verstrooid wordt loodrecht op de lichtbron. Bij geen
verstrooiing, geen cel. Bij neutrofielen veel lichtverstrooiing als je granules hebt.
Granules, kern, vorm ER en golgi zorgen voor verstrooiing.
Multi parametrische dotplot
- Forward scatter voor grootte, side scatter voor granules.
- Rechtsboven granulocyten: grote cellen met veel granules, hoge interne complexiteit. Hoge
voorwaartse en zijwaartse verstrooiing.
- Midden: gemengde populatie, meeste immuuncellen. Leucocyten, monocyten en
macrofagen. Kleine tot middelgrote cellen met lage interne complexiteit/granulariteit.
Medium forward-scatter en lage side-scatter signaalintensiteit.
- D: Debrie, kapotte cellen. Zeer kleine voorwerpen met lage voorwaartse en zijwaartse
verstrooiing.
, - Na vaccinatie of infectie treedt er een verschuiving op van cellen met een
bepaalde merker. Prostimulatorische cellen die hoog tot expressie komen bij
een gevaarsignaal
Immunologische kleuringen
- Links klassieke populatie door flow cytometrie met side en forward scatter
- Rechts het resultaat van CD4 en CD8 kleuring
- De puntjes links en rechts zijn dezelfde cellen, maar krijgen een andere plaats.
We weten niet welk puntje in de linkse figuur, waar in de rechtse figuur zit.
- Bij gating ofwel regio’s bepalen dan rond een bepaalde populatie een
lijn trekken. Dan in andere plots ook duidelijk als rode puntjes.
Immuniteit tegenover virussen
- Immuunsysteem herkent dat er lichaamsvreemde stoffen aanwezig zijn door
patroonherkenningsreceptoren, die herkennen of er een bacterie of virus aanwezig is.
- Bij bacteriën een arsenaal aan receptoren voor bacteriële factoren, bij virussen moeilijker te zien, de
cellen maken dan zelf virale eiwitten aan.
- Patroonherkenningsreceptoren van het aangeboren immuunsysteem zijn niet geschikt om eigen
eiwitten aan te maken, herkenning door aangeboren immuunsysteem heel moeilijk.
- Kijken naar zaken die normaal niet te zien zijn in een normale cel. Bacteriële
celwand heeft veel verschillende suikers en zaken die het eigen lichaam niet
heeft. Viraal eiwit moeilijk of niet te herkennen.
- Uniek voor virussen: Bij RNA-virussen dubbelstrengig RNA aangemaakt als
intermediair tijdens de replicatie, dat is een sterke trigger om interferon-alfa te
induceren
- Bij DNA-virussen is viraal RNA anders aangepast, dat gaat het immuunsysteem
herkennen. Sterke reactie op intermediaire componenten van het genoom die
vermeerderd worden in de cel.
- Patronen bij virussen op het moment dat capsid gemaakt wordt, meestal een
herhaling van een aantal eiwitten die continu voorkomen in een bepaalde orde,
dat kan herkend worden tijdens de replicatie.
Innate/aangeboren immuniteit: patroonherkenningsreceptoren antivirale sensoren
- Virussen bevatten geen gemakkelijk herkenbare microbe-specifieke structuren, zijn opgebouwd uit
host afgeleide componenten.
- Twee complementaire receptorsystemen herkennen virale nucleïnezuren
o Nucleïnezuursensoreiwitten die in het cytosol van alle kernhoudende cellen worden
aangetroffen. RIG-1 en MDA5 detecteren viraal dsRNA geproduceerd door virale infectie,
signaleren vervolgens via adaptereiwitten om IFN-β-gen te activeren
o TOLL-Like receptoren: TLR3 herkent dsRNA. TLR7 en TLR8 herkennen enkelstrengs RNA-
virussen zoals vesiculaire stomatitis en influenzavirussen. TLR9 detecteert ongemethyleerde
CpG-motieven in DNA
Aangeboren immuniteit: interferonen
- Interferonen zijn cytokinen die andere cellen beschermen tegen virale invasie, zijn glycoproteïnen
- Ze beschermen de cel die geïnfecteerd is, maar ook naburige cellen tegen infectie.
- Bestaan uit drie grote types, 1, 2 en 3, de meeste komen voor bij type-1
