MBE Meetrapport kolonie-PCR
Leerjaar 2 Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek MBE
Doel kolonie-PCR
Met de kolonie-PCR kan worden gecontroleerd of de ingebrachte insertie in de plasmide aanwezig is
en of deze in de juiste oriëntatie aanwezig is. Dit wordt gedaan met behulp van primers die aan een
specifieke sequentie in de insertie en in de plasmide binden. Hierdoor wordt er een product gevormd
van bekende grootte. Als het resultaat overeenkomt met deze grootte, is de oriëntatie juist.
In deze proef wordt gecontroleerd of het H2B-gen met GFP juist is gekloneerd in plasmide pDM317.
Na het uitvoeren van de kolonie PCR wordt een gelelektroforese uitgevoerd. Op deze manier kan de
grootte van de DNA-fragmenten worden weergeven. Aan de hand hiervan kan worden bepaald of de
insertie aanwezig is en of deze in de juiste oriëntatie in de plasmide zit.
Verwachting kolonie-PCR
Voor het uitvoeren van de kolonie PCR wordt er een mastermix bereid met componenten die aan de
monsters moeten worden toegevoegd. Er is een mastermix gemaakt voor 7 reacties, bestaande uit:
- 92,75 µl milliQ
- 17,5 µl 10x PCR reactiebuffer
- 7 µl Forward primer
- 7 µl Reverse primer
- 8,75 µl dNTP’s
- 7 µl Taq-DNA-polymerase
In onderstaande tabel 1 zijn de verwachtingen van de monsters voor de PCR weergeven.
Tabel 1: verwachtingen van de kolonie-PCR
Reacti Input (monster) Verwachting
e
1 Ligatiemengsel: pDM317 en H2B + GFP aan elkaar 613 bp
geligeerd. Verkregen uit transformatie 1.
Mastermix
2 Ligatiemengsel: pDM317 en H2B + GFP aan elkaar 613 bp
geligeerd. Verkregen uit transformatie 1.
Positieve
controle Mastermix
3 Ongeknipt plasmide (zonder H2B). Verkregen uit Geen bandje, want er
Negatiev transformatie 3. is geen insertie
e aanwezig waar de
controle Mastermix primers aan kunnen
hechten.
4 MilliQ en mastermix (blanco) Geen bandje, want er
is geen insertie
aanwezig waar de
primers aan kunnen
hechten.
Leerjaar 2 Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek MBE
Doel kolonie-PCR
Met de kolonie-PCR kan worden gecontroleerd of de ingebrachte insertie in de plasmide aanwezig is
en of deze in de juiste oriëntatie aanwezig is. Dit wordt gedaan met behulp van primers die aan een
specifieke sequentie in de insertie en in de plasmide binden. Hierdoor wordt er een product gevormd
van bekende grootte. Als het resultaat overeenkomt met deze grootte, is de oriëntatie juist.
In deze proef wordt gecontroleerd of het H2B-gen met GFP juist is gekloneerd in plasmide pDM317.
Na het uitvoeren van de kolonie PCR wordt een gelelektroforese uitgevoerd. Op deze manier kan de
grootte van de DNA-fragmenten worden weergeven. Aan de hand hiervan kan worden bepaald of de
insertie aanwezig is en of deze in de juiste oriëntatie in de plasmide zit.
Verwachting kolonie-PCR
Voor het uitvoeren van de kolonie PCR wordt er een mastermix bereid met componenten die aan de
monsters moeten worden toegevoegd. Er is een mastermix gemaakt voor 7 reacties, bestaande uit:
- 92,75 µl milliQ
- 17,5 µl 10x PCR reactiebuffer
- 7 µl Forward primer
- 7 µl Reverse primer
- 8,75 µl dNTP’s
- 7 µl Taq-DNA-polymerase
In onderstaande tabel 1 zijn de verwachtingen van de monsters voor de PCR weergeven.
Tabel 1: verwachtingen van de kolonie-PCR
Reacti Input (monster) Verwachting
e
1 Ligatiemengsel: pDM317 en H2B + GFP aan elkaar 613 bp
geligeerd. Verkregen uit transformatie 1.
Mastermix
2 Ligatiemengsel: pDM317 en H2B + GFP aan elkaar 613 bp
geligeerd. Verkregen uit transformatie 1.
Positieve
controle Mastermix
3 Ongeknipt plasmide (zonder H2B). Verkregen uit Geen bandje, want er
Negatiev transformatie 3. is geen insertie
e aanwezig waar de
controle Mastermix primers aan kunnen
hechten.
4 MilliQ en mastermix (blanco) Geen bandje, want er
is geen insertie
aanwezig waar de
primers aan kunnen
hechten.
