Angewandte Genetik
Werkzeuge der Gentechnik
- Restriktionsenzyme
- DNA-Ligasen
- DNA-Polymerasen
- Reverse Transkriptasen
- Geeignete Vektoren mit Schnittstellen für Restriktionsenzyme und Marker für die
Selektion
Methoden der Gentechnik
Erzeugung transgener - Isolierung und Bearbeitung der DNA eines
Bakterien Spenderorganismus; Zerschneiden der DNA mit einem
Restriktionsenzym; Identifizierung, Isolation und ggf.
Vermehrung durch PCR des gewünschten Gens
- Gewinnung von Plasmiden aus Bakterienzellen und
Aufschneiden der Plasmide mit dem gleichen
Restriktionsenzym wie bei der Spender-DNA
- Die Hybridisierung erfolgt, indem die sticky-ends sich
komplementär binden und durch die Ligase verknüpft werden
- Das Hybridplasmid wird in die Bakterienzelle übertragen
Selektion transgener Einschleusen erfolgreich?
Bakterien - Transgene Zellen werden auf Nährboden gegeben und es wird
geschaut, welche Bakterien sich vermehren und Plasmid mit
Fremd-DNA enthalten
a. Kein Plasmid aufgenommen: sterben auf Nährboden
b. Plasmid ohne Fremd-DNA: farblich erkennbar
c. Plasmid mit Fremd-DNA: farblich erkennbar
PCR - Erzielt die zyklische Vermehrung kleinster Mengen an DANN
innerhalb einer kurzen Zeitspanne
- Man braucht die zu vervielfältigende Doppelstrang-DNA, die
Taq-Polymerase, DNA-Nukleotide und Primer
- Durch Denaturierung wird der Doppelstrang bei etwa 90°C
aufgetrennt
- Bei etwa 50-60°C werden Primer am 3S Ende angelagert
- Der komplementäre Strang wird bei 70°C mithilfe der Taq-
Polymerase synthetisiert
- Bei jedem Zyklus wird die DNA-Menge verdoppelt
Gelelektrophorese Auftrennung von Molekül-Gemischen (DNA, RNA und Proteine)
- Anwendung bei DNA-Vergleichen in der Kriminologie oder
Vaterschaftstest
- Aufbau von Gel und elektrischem Feld aus Anode (+) und
Kathode (-)
- DNA wird auf der negativ geladenen Seite ins Gel gegeben
- Negativ geladene Teile der DNA, die Phosphatmoleküle,
wandern unterschiedlich schnell zur Anode durch das Gel
- Die DNA-Teile die die gleiche Größe, Ladung und Gestalt
haben reihen sich in einer Bande an
, - Das Bandenmuster wird durch Fluoreszenzfarbstoff sichtbar
gemacht und kann verglichen werden
Genetischer Identifizierung einer Person durch Vergleichen mehrerer DNA-
Fingerabdruck Abschnitte ohne genetische Information
- DNA-Proben werden isoliert und mittels PCR vervielfältigt
- Es werden DNA-Restriktionsfragmente gebildet, indem die
Proben mit dem gleichen Restriktionsenzym zerschnitten
werden
- Die Fragmente werden durch Gelelektrophorese aufgetrennt
und das Bandenmuster kann verglichen werden
DNA-Sequenzierung Bestimmung einer unbekannten Basenabfolge zu
Forschungszwecken wie die Erkennung von Erbkrankheiten
- Zu ermittelnder DNA-Strang wird vervielfältigt und durch
Denaturierung in Einzelstränge geteilt
- Kleiner Teil muss bekannt sein, um Primer zu präparieren
- DNA-Einzelstrang mit Primer werden gemeinsam mit
Nucleotiden und DNA-Polymerase in vier Gefäße gegeben
- Jedes Glas bekommt ein spezifisches Stopp-Nucleotid
(Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin)
- Die Polymerasen bauen verschieden lange Stränge jedoch
immer mit derselben Reihenfolge; Die Stränge enden immer
mit der jeweiligen Base ihres Gefäßes
- Mittels der Gelelektrophorese werden die Stränge nach ihrer
Länge sortiert
- Die Sequenz der letzten Basen wird von unten nach oben
(kurz nach lang) im Bandenmuster abgelesen
- Diese Sequenz muss entsprechend den komplementären
Basenpaaren umgestellt werden und man endet mit der
Basenabfolge der ursprünglichen DNA
Chancen und Risiken der Gentechnik
Gentechnik Gendiagnostik Gentherapie
Ziel Transgene Zellen als Genetisch bedingte Verfahren bei
Biokatalysatoren und Krankheiten, dem Gene gezielt
Produzenten; zukünftig Defekte oder in das Erbgut
sogar Zellen mit Merkmale eingeschleust
maßgeschneidertem nachweisen und werden um
Genom oder identifizieren Defekte zu
synthetische Zellen beseitigen
Anwendungsbereich Medizin, Frühzeitiges Somatisch:
Lebensmittelherstellung, Feststellen von mutierte Gene
Rohstoffgewinnung, Erbkrankheiten; werden ersetzt
Umweltschutz Humangenetische aber sind nicht
Beratung; vererbbar
Täteridentifikation Keimbahn:
Ersetzen von
Genen in
Keimzellen und
Werkzeuge der Gentechnik
- Restriktionsenzyme
- DNA-Ligasen
- DNA-Polymerasen
- Reverse Transkriptasen
- Geeignete Vektoren mit Schnittstellen für Restriktionsenzyme und Marker für die
Selektion
Methoden der Gentechnik
Erzeugung transgener - Isolierung und Bearbeitung der DNA eines
Bakterien Spenderorganismus; Zerschneiden der DNA mit einem
Restriktionsenzym; Identifizierung, Isolation und ggf.
Vermehrung durch PCR des gewünschten Gens
- Gewinnung von Plasmiden aus Bakterienzellen und
Aufschneiden der Plasmide mit dem gleichen
Restriktionsenzym wie bei der Spender-DNA
- Die Hybridisierung erfolgt, indem die sticky-ends sich
komplementär binden und durch die Ligase verknüpft werden
- Das Hybridplasmid wird in die Bakterienzelle übertragen
Selektion transgener Einschleusen erfolgreich?
Bakterien - Transgene Zellen werden auf Nährboden gegeben und es wird
geschaut, welche Bakterien sich vermehren und Plasmid mit
Fremd-DNA enthalten
a. Kein Plasmid aufgenommen: sterben auf Nährboden
b. Plasmid ohne Fremd-DNA: farblich erkennbar
c. Plasmid mit Fremd-DNA: farblich erkennbar
PCR - Erzielt die zyklische Vermehrung kleinster Mengen an DANN
innerhalb einer kurzen Zeitspanne
- Man braucht die zu vervielfältigende Doppelstrang-DNA, die
Taq-Polymerase, DNA-Nukleotide und Primer
- Durch Denaturierung wird der Doppelstrang bei etwa 90°C
aufgetrennt
- Bei etwa 50-60°C werden Primer am 3S Ende angelagert
- Der komplementäre Strang wird bei 70°C mithilfe der Taq-
Polymerase synthetisiert
- Bei jedem Zyklus wird die DNA-Menge verdoppelt
Gelelektrophorese Auftrennung von Molekül-Gemischen (DNA, RNA und Proteine)
- Anwendung bei DNA-Vergleichen in der Kriminologie oder
Vaterschaftstest
- Aufbau von Gel und elektrischem Feld aus Anode (+) und
Kathode (-)
- DNA wird auf der negativ geladenen Seite ins Gel gegeben
- Negativ geladene Teile der DNA, die Phosphatmoleküle,
wandern unterschiedlich schnell zur Anode durch das Gel
- Die DNA-Teile die die gleiche Größe, Ladung und Gestalt
haben reihen sich in einer Bande an
, - Das Bandenmuster wird durch Fluoreszenzfarbstoff sichtbar
gemacht und kann verglichen werden
Genetischer Identifizierung einer Person durch Vergleichen mehrerer DNA-
Fingerabdruck Abschnitte ohne genetische Information
- DNA-Proben werden isoliert und mittels PCR vervielfältigt
- Es werden DNA-Restriktionsfragmente gebildet, indem die
Proben mit dem gleichen Restriktionsenzym zerschnitten
werden
- Die Fragmente werden durch Gelelektrophorese aufgetrennt
und das Bandenmuster kann verglichen werden
DNA-Sequenzierung Bestimmung einer unbekannten Basenabfolge zu
Forschungszwecken wie die Erkennung von Erbkrankheiten
- Zu ermittelnder DNA-Strang wird vervielfältigt und durch
Denaturierung in Einzelstränge geteilt
- Kleiner Teil muss bekannt sein, um Primer zu präparieren
- DNA-Einzelstrang mit Primer werden gemeinsam mit
Nucleotiden und DNA-Polymerase in vier Gefäße gegeben
- Jedes Glas bekommt ein spezifisches Stopp-Nucleotid
(Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin)
- Die Polymerasen bauen verschieden lange Stränge jedoch
immer mit derselben Reihenfolge; Die Stränge enden immer
mit der jeweiligen Base ihres Gefäßes
- Mittels der Gelelektrophorese werden die Stränge nach ihrer
Länge sortiert
- Die Sequenz der letzten Basen wird von unten nach oben
(kurz nach lang) im Bandenmuster abgelesen
- Diese Sequenz muss entsprechend den komplementären
Basenpaaren umgestellt werden und man endet mit der
Basenabfolge der ursprünglichen DNA
Chancen und Risiken der Gentechnik
Gentechnik Gendiagnostik Gentherapie
Ziel Transgene Zellen als Genetisch bedingte Verfahren bei
Biokatalysatoren und Krankheiten, dem Gene gezielt
Produzenten; zukünftig Defekte oder in das Erbgut
sogar Zellen mit Merkmale eingeschleust
maßgeschneidertem nachweisen und werden um
Genom oder identifizieren Defekte zu
synthetische Zellen beseitigen
Anwendungsbereich Medizin, Frühzeitiges Somatisch:
Lebensmittelherstellung, Feststellen von mutierte Gene
Rohstoffgewinnung, Erbkrankheiten; werden ersetzt
Umweltschutz Humangenetische aber sind nicht
Beratung; vererbbar
Täteridentifikation Keimbahn:
Ersetzen von
Genen in
Keimzellen und
