Enzymkinetiek: recap
Eiwit
o Katalysator: component die chemische reacties kunnen versnellen/vertragen (10 9 tot 1012x)
=> onmogelijke reacties blijven onmogelijk
o Lage concentratie (10-11 M)
o Fysiologische omstandigheden: lage T en neutrale pH
o Worden niet verbruikt, wel vervangen
o Denatureren (doodsoorzaak)
o Globulair wateroplosbaar
Werking
Katalytische werking
o Versnellen een chemische reactie
o Enzym + substraat = enzymsubstraat –> product
Actief centrum
o Sleutel-slot principe: exact passen op elkaar (starre structuur)
o Induced fit: ongeveer passen op elkaar –> bij contact: enzym past zich aan aan de vorm van het substraat
(flexibele structuur)
Specificiteit
o Zwakke specificiteit/groepsspecifiteit: 1 enzym voor 1 substraat
o Absolute specificiteit van reactie en substraat: meerdere gelijkende enzymen voor een substraat
Controlemechanismen
o Controle via synthese: enzymen bijmaken of afbreken
o Controle wijziging id covalente structuur: niet actief enzym –> actief enzym (dmv andere enzymen)
Irreversibel
o Allosterische controle: activator/inhibitor dmv effector
Revesiebel
Beïnvloedende factoren van enzymwerking
Temperatuur
o Bij lage T valt het enzym stil
o Als T toeneemt, neemt reactiesnelheid ook toe
o Bij te hoge T gaat het enzym denatureren en valt de reactie stil
o Elk EW heeft optimale werkingsT en denaturatieT
pH
o Reactie laten doorgaan in cte pH –> buffer gebruiken
o Elk enzym heeft optimale pH
Enzymconcentratie
Substraatconcentratie
Inhibitoren
o Competitieve inhibitoren
Inhibitor gelijkt op substraat en bind eveneens op actieve site
o Niet-competitieve inhibitor
Inhibitor bindt enzym op andere plek dan actieve site, maar deze binding wijzigt actieve site
Enzymkinetiek
Eénsubstraatsreacties
Steady-state kinetiek
= als de gevormde hoeveelheid die gevormd wordt gelijk is aan de hoeveelheid die verdwijnt
Pre-steady-state: als enzymen gemengd wordt met overmaat substraat, is er een korte periode waarin evenwicht
wordt gezocht
Post-steady-state: als al de enzymen gebonden zijn aan substraat, zal de reactie stilvallen
Michaëlis-Menten vergelijking
Bij cte [E] is snelheid rechtevenredig met [S] wnnr [S] klein is
Voor hoge [S] id reactiesnelheid onafh vd [S]
1
, In steady-state vwd: verdwijning van ES per tijdseenheid = vorming van ES per tijdseenheid
Verder geldt dat:
o C aan vrije substraten = beginC (aangezien dat [S] >> [E])
o [Et] = [E] + [ES]
Vmax wordt verkregen wnnr alle actieve centra verzadigd zijn met substraat (wnnr [S] >> [E])
Betekenis van de parameters:
KM
[S] waarbij helft vd actieve centra is gebonden met substraat
Dissociatie-cte = maat voor affiniteit tss enzym en substraat OF functionaliteit bij lage [E]
o KM klein: grote affiniteit (Vmax/2 al bereikt bij kleine [S])
o KM groot: kleine affiniteit (Vmax/2 bereikt bij grote [S])
Waarde wordt bepaald door: aard vh substraat in combinatie met soort enzym, pH, T en ionsterkte
Vmax
= reactiesnelheid waarbij alle actieve centra verzadigd zijn aan substraat
Uit Vmax kan ‘turnover number’ berekend worden
o Max aantal substraatmoleculen dat per actief centrum en per tijdseenheid omgezet wordt in product
o Aantal keren dat het enzym ‘turns over’ per tijdseenheid
o => maat voor het katalytisch vermogen vh enzym voor een bepaald substraat
o Ligt tss 1 tot 104 per seconde
o Elke omzetting gebeurt 1/K3
MM-vgl getransformeerd in een lineaire vorm:
Lineweaver-Burk
o Nadeel
Door reciproke waarde (1/x) wegen fouten zwaarder door
Dikwijls slechte spreiding vd punten waarbij kleinste [S] het sterkste doorwegen
Hanes
o Voordeel
Statistisch beste methode: minder gevoelig voor fouten
Mooiere spreiding vd punten
o Nadeel: reciproke waarde van snelheidsreactie blijven behouden
Inhibitie
= verlagen vd reactiesnelheid
Mechanismen
o Binding met actieve site blokkeren (competitief)
o Activiteit vd actieve site verlagen (niet-competitief)
o Chemische reacties (irrevesiebel)
o Omgevingsfactoren veranderen (T en pH)
Belang van inhibitoren
o Regulatiemechanismen
o Medicatie
o Biologisch inzicht
Reversiebele inhibitie: gekenmerkt door evenwichtsinstelling tss enzym en substraat
Reversiebele inhibitie vd enzymatische reacties door kleine moleculen en ionen is van groot belang:
Als controle mechanisme in biologische systemen
Het verschaft inzicht ih werkingsmechanisme vh enzym
Id pharmaceutische industrie om de affiniteit vd versch inhibitoren voor een bep enzym te kennen
Competitieve inhibitie
Inhibitor bindt op dezelfde plaats als substraat: ze zijn in competitie met elkaar
Reactiesnelheid daalt doordat minder substraat kan binden
Inhibitor en substraat gelijken chemisch op elkaar
Schijnbaar wordt KM groter: [S] moet hoger zijn om dezelfde snelheid te behouden
2
, o [I] > [S]: geen reactie
o [I] = [S]: verminderde reactie (vereist een hogere [S] om Vmax en Vmax/2 te bereiken)
o [I] < [S]: geen/weinig inhibitie (inhibitie kan opgeheven worden door te werken bij zeer hoge [S])
Niet-competitieve inhibitie = allosterische inhibitie
Inhibitor bindt NIET op het actief centrum: enzym ondergaat conformatie –> verliest activiteit
Geen chemische gelijkenis tss inhibitor en substraat –> geen competitie
Dikwijls wordt door binding de katalyse belet (functionaliteit valt weg)
Schijnbaar daalt Vmax
Inhibitie kan niet ongedaan gemaakt worden door verhogen van [S]
Binding vd inhibitor beïnvloedt de binding vh substraat niet: KM blijft onveranderd
Bepaling van KM, Vmax en KI
1. Substraatsverdunningsreeks maken
2. Voor versch [S] wordt reactiesnelheid bepaals in aan- en afwezigheid van inhibitor
3. Voor elke grafisch uitzetten –> lineaire afgeleide
4. Lineaire regressie met vgl van best passende vgl (y = ax + b)
a. Geïnhibeerde rechte is evenwijdig aan niet-geïnhibeerde rechte: competitieve inhibitie
b. Geïnhibeerde rechte is NIET evenwijdig aan niet-geïnhibeerde rechte: niet-competitieve inhibitie
5. a en b bep voor de versch rechten: betekenis veranderd naargelang geen, comp of niet-comp inhibitie
6. Aflezen/berekenen: KM, Vmax uit a en b van de niet-geïnhibeerde reactie
[I ]
7. Berekenen KI: geïnhibeerde reactie (bi) delen door niet-geïnhibeerde reactie (b) => KI = bi
−1
b
Substraatinhibitie
Bij hoge [S]: zowel competitief als niet-competitief
MM geldt niet meer: curves zijn niet langer hyperbolisch
Bij zeer hoge [S] daalt de reactiesnelheid
2e substraatmolecule kan op hetzelfde actief centrum zitten als het 1e, maar beide kunnen slecht zitten
Kan ook op andere plaats op het EW binden en zo binding/afbraak op actief centrum beïnvloeden
Productinhibitie
Gevormd product gaat zelf als remmer optreden
Feedbackinhibitie: inhibitie stopt wanneer product opgebruikt is
Product bindt op actief centrum: reactie stopt spontaan tot de inhibitor verbuikt is
Product bindt NIET op actief centrum: door conformationele wijziging in EW wordt binding en/of afbraak vh
substraat op actief centrum beïnvloed of belet
Inhibitie door allosterische enzymen
Volgen niet MM: sigmoïdale curve ipv hyperbolische
Meeste van dit type enzymen zijn opgebouwd uit versch ondereenheden (sub-units) elk met een actief centrum
Binden v/e substraat op 1 vd actieve centra veroorzaakt wijziging id binding en/of afbraak op een andere actieve
plaats binnen dezelfde enzym molecule => coöperatief effect
Meestal enzymen met regulatorische of controlende functie
Activator/inhibitor: binden niet op actieve centra (allosterische controle) –> indien 100% activatie: MM
Homotropische interacties: substraatbinding heeft effect op binding v/e ander e substraatsmolecule
Heterotropische interacties: allosterische effector (product, metaalion, coënzym) veroorzaakt de wijziging
Belang van allosterische enzymen: komt vooral tot uiting bij het nagaan vd invloed van inhibtor of activator
o 2 conformationele vormen: T-vorm (geen binding van substraat mog) en R-vorm (binding wel mog)
=> in evenwicht (L = T/R)
o Activator en inhibitor binden op een andere plaats dan het actieve centrum
Allosterische inhibitor: voorkeur voor T-vorm
Allosterische activator: voorkeur voor R-vorm
Irreversiebele inhibitie
Wordt verkregen wnnr een inhibitor een chemische binding (meestal covalent) aangaat met het enzym
3
Eiwit
o Katalysator: component die chemische reacties kunnen versnellen/vertragen (10 9 tot 1012x)
=> onmogelijke reacties blijven onmogelijk
o Lage concentratie (10-11 M)
o Fysiologische omstandigheden: lage T en neutrale pH
o Worden niet verbruikt, wel vervangen
o Denatureren (doodsoorzaak)
o Globulair wateroplosbaar
Werking
Katalytische werking
o Versnellen een chemische reactie
o Enzym + substraat = enzymsubstraat –> product
Actief centrum
o Sleutel-slot principe: exact passen op elkaar (starre structuur)
o Induced fit: ongeveer passen op elkaar –> bij contact: enzym past zich aan aan de vorm van het substraat
(flexibele structuur)
Specificiteit
o Zwakke specificiteit/groepsspecifiteit: 1 enzym voor 1 substraat
o Absolute specificiteit van reactie en substraat: meerdere gelijkende enzymen voor een substraat
Controlemechanismen
o Controle via synthese: enzymen bijmaken of afbreken
o Controle wijziging id covalente structuur: niet actief enzym –> actief enzym (dmv andere enzymen)
Irreversibel
o Allosterische controle: activator/inhibitor dmv effector
Revesiebel
Beïnvloedende factoren van enzymwerking
Temperatuur
o Bij lage T valt het enzym stil
o Als T toeneemt, neemt reactiesnelheid ook toe
o Bij te hoge T gaat het enzym denatureren en valt de reactie stil
o Elk EW heeft optimale werkingsT en denaturatieT
pH
o Reactie laten doorgaan in cte pH –> buffer gebruiken
o Elk enzym heeft optimale pH
Enzymconcentratie
Substraatconcentratie
Inhibitoren
o Competitieve inhibitoren
Inhibitor gelijkt op substraat en bind eveneens op actieve site
o Niet-competitieve inhibitor
Inhibitor bindt enzym op andere plek dan actieve site, maar deze binding wijzigt actieve site
Enzymkinetiek
Eénsubstraatsreacties
Steady-state kinetiek
= als de gevormde hoeveelheid die gevormd wordt gelijk is aan de hoeveelheid die verdwijnt
Pre-steady-state: als enzymen gemengd wordt met overmaat substraat, is er een korte periode waarin evenwicht
wordt gezocht
Post-steady-state: als al de enzymen gebonden zijn aan substraat, zal de reactie stilvallen
Michaëlis-Menten vergelijking
Bij cte [E] is snelheid rechtevenredig met [S] wnnr [S] klein is
Voor hoge [S] id reactiesnelheid onafh vd [S]
1
, In steady-state vwd: verdwijning van ES per tijdseenheid = vorming van ES per tijdseenheid
Verder geldt dat:
o C aan vrije substraten = beginC (aangezien dat [S] >> [E])
o [Et] = [E] + [ES]
Vmax wordt verkregen wnnr alle actieve centra verzadigd zijn met substraat (wnnr [S] >> [E])
Betekenis van de parameters:
KM
[S] waarbij helft vd actieve centra is gebonden met substraat
Dissociatie-cte = maat voor affiniteit tss enzym en substraat OF functionaliteit bij lage [E]
o KM klein: grote affiniteit (Vmax/2 al bereikt bij kleine [S])
o KM groot: kleine affiniteit (Vmax/2 bereikt bij grote [S])
Waarde wordt bepaald door: aard vh substraat in combinatie met soort enzym, pH, T en ionsterkte
Vmax
= reactiesnelheid waarbij alle actieve centra verzadigd zijn aan substraat
Uit Vmax kan ‘turnover number’ berekend worden
o Max aantal substraatmoleculen dat per actief centrum en per tijdseenheid omgezet wordt in product
o Aantal keren dat het enzym ‘turns over’ per tijdseenheid
o => maat voor het katalytisch vermogen vh enzym voor een bepaald substraat
o Ligt tss 1 tot 104 per seconde
o Elke omzetting gebeurt 1/K3
MM-vgl getransformeerd in een lineaire vorm:
Lineweaver-Burk
o Nadeel
Door reciproke waarde (1/x) wegen fouten zwaarder door
Dikwijls slechte spreiding vd punten waarbij kleinste [S] het sterkste doorwegen
Hanes
o Voordeel
Statistisch beste methode: minder gevoelig voor fouten
Mooiere spreiding vd punten
o Nadeel: reciproke waarde van snelheidsreactie blijven behouden
Inhibitie
= verlagen vd reactiesnelheid
Mechanismen
o Binding met actieve site blokkeren (competitief)
o Activiteit vd actieve site verlagen (niet-competitief)
o Chemische reacties (irrevesiebel)
o Omgevingsfactoren veranderen (T en pH)
Belang van inhibitoren
o Regulatiemechanismen
o Medicatie
o Biologisch inzicht
Reversiebele inhibitie: gekenmerkt door evenwichtsinstelling tss enzym en substraat
Reversiebele inhibitie vd enzymatische reacties door kleine moleculen en ionen is van groot belang:
Als controle mechanisme in biologische systemen
Het verschaft inzicht ih werkingsmechanisme vh enzym
Id pharmaceutische industrie om de affiniteit vd versch inhibitoren voor een bep enzym te kennen
Competitieve inhibitie
Inhibitor bindt op dezelfde plaats als substraat: ze zijn in competitie met elkaar
Reactiesnelheid daalt doordat minder substraat kan binden
Inhibitor en substraat gelijken chemisch op elkaar
Schijnbaar wordt KM groter: [S] moet hoger zijn om dezelfde snelheid te behouden
2
, o [I] > [S]: geen reactie
o [I] = [S]: verminderde reactie (vereist een hogere [S] om Vmax en Vmax/2 te bereiken)
o [I] < [S]: geen/weinig inhibitie (inhibitie kan opgeheven worden door te werken bij zeer hoge [S])
Niet-competitieve inhibitie = allosterische inhibitie
Inhibitor bindt NIET op het actief centrum: enzym ondergaat conformatie –> verliest activiteit
Geen chemische gelijkenis tss inhibitor en substraat –> geen competitie
Dikwijls wordt door binding de katalyse belet (functionaliteit valt weg)
Schijnbaar daalt Vmax
Inhibitie kan niet ongedaan gemaakt worden door verhogen van [S]
Binding vd inhibitor beïnvloedt de binding vh substraat niet: KM blijft onveranderd
Bepaling van KM, Vmax en KI
1. Substraatsverdunningsreeks maken
2. Voor versch [S] wordt reactiesnelheid bepaals in aan- en afwezigheid van inhibitor
3. Voor elke grafisch uitzetten –> lineaire afgeleide
4. Lineaire regressie met vgl van best passende vgl (y = ax + b)
a. Geïnhibeerde rechte is evenwijdig aan niet-geïnhibeerde rechte: competitieve inhibitie
b. Geïnhibeerde rechte is NIET evenwijdig aan niet-geïnhibeerde rechte: niet-competitieve inhibitie
5. a en b bep voor de versch rechten: betekenis veranderd naargelang geen, comp of niet-comp inhibitie
6. Aflezen/berekenen: KM, Vmax uit a en b van de niet-geïnhibeerde reactie
[I ]
7. Berekenen KI: geïnhibeerde reactie (bi) delen door niet-geïnhibeerde reactie (b) => KI = bi
−1
b
Substraatinhibitie
Bij hoge [S]: zowel competitief als niet-competitief
MM geldt niet meer: curves zijn niet langer hyperbolisch
Bij zeer hoge [S] daalt de reactiesnelheid
2e substraatmolecule kan op hetzelfde actief centrum zitten als het 1e, maar beide kunnen slecht zitten
Kan ook op andere plaats op het EW binden en zo binding/afbraak op actief centrum beïnvloeden
Productinhibitie
Gevormd product gaat zelf als remmer optreden
Feedbackinhibitie: inhibitie stopt wanneer product opgebruikt is
Product bindt op actief centrum: reactie stopt spontaan tot de inhibitor verbuikt is
Product bindt NIET op actief centrum: door conformationele wijziging in EW wordt binding en/of afbraak vh
substraat op actief centrum beïnvloed of belet
Inhibitie door allosterische enzymen
Volgen niet MM: sigmoïdale curve ipv hyperbolische
Meeste van dit type enzymen zijn opgebouwd uit versch ondereenheden (sub-units) elk met een actief centrum
Binden v/e substraat op 1 vd actieve centra veroorzaakt wijziging id binding en/of afbraak op een andere actieve
plaats binnen dezelfde enzym molecule => coöperatief effect
Meestal enzymen met regulatorische of controlende functie
Activator/inhibitor: binden niet op actieve centra (allosterische controle) –> indien 100% activatie: MM
Homotropische interacties: substraatbinding heeft effect op binding v/e ander e substraatsmolecule
Heterotropische interacties: allosterische effector (product, metaalion, coënzym) veroorzaakt de wijziging
Belang van allosterische enzymen: komt vooral tot uiting bij het nagaan vd invloed van inhibtor of activator
o 2 conformationele vormen: T-vorm (geen binding van substraat mog) en R-vorm (binding wel mog)
=> in evenwicht (L = T/R)
o Activator en inhibitor binden op een andere plaats dan het actieve centrum
Allosterische inhibitor: voorkeur voor T-vorm
Allosterische activator: voorkeur voor R-vorm
Irreversiebele inhibitie
Wordt verkregen wnnr een inhibitor een chemische binding (meestal covalent) aangaat met het enzym
3
