Fosfaat: een competitieve
remmer bij de alkalische fosfatase
activiteit
Voornaam Achternaam (studentennummer)
Samenvatting
De vraagstelling van dit onderzoek is of fosfaat als een competitieve of een non-competitieve
remmer werkt bij het remmen van de alkalische fosfatase activiteit. De probleemstelling bij deze
vraag is dat als fosfaat een non-competitieve remmer is, de enzymbepaling storend bevonden
wordt waardoor de alkalische fosfatase waarde onbetrouwbaar is.
Om dit te kunnen beslissen, wordt productievorming met en zonder de remmer bekeken bij
dezelfde hoeveelheid substraat. In een Lineweaver-Burk plot kan men de verschillen in de
Michaelis-Menten constanten (Km) en de maximale snelheden (Vmax) van de alkalische fosfatase
activiteit zien.
De gevonden meetwaarden van de productievorming met de remmer hebben een Km van 0,2
mmol/L en een Vmax van 140 nmol/min. De gevonden meetwaarden van de productievorming
zonder de remmer hebben een Km van 0,1 mM en een Vmax van 200 nmol/min.
Uit de resultaten wordt de conclusie getrokken dat de alkalische fosfatase activiteit wordt
geremd door een competitieve remmer. Hierdoor zal fosfaat de enzymbepaling niet storen, de
alkalische fosfatase waarde betrouwbaar houden en voor spectrofotometrische bepaling ervan
kunnen worden gebruikt.
Inleiding
Alkalische fosfatase (EC 3.1.3.1) is een enzym dat organische fosfaatesters hydrolyseert. Het in
humaan plasma aanwezige enzym is vooral afkomstig van lever- en galepitheel, en van
osteoblasten (1). De alkalische fosfatase activiteit in plasma is sterk verhoogd in patiënten met
cholestase door galwegobstructie, bij sommige leveraandoeningen en bepaalde
botstofwisselingsziekten. Meting van alkalische fosfatase activiteit in plasma heeft dan ook een
belangrijk rol in de diagnostiek van deze aandoeningen (1).
De spectrofotometrische bepaling van de alkalische fosfatase activiteit is gebaseerd op de
omzetting van het kleurloze p-nitrofenylfosfaat in het geelgekleurde p-nitrofenol. De bepaling
van de hoeveelheid aanwezig enzym vindt plaats onder Vmax condities, hetgeen voor een
Michaelis-Menten enzym betekent bij een substraatconcentratie van minimaal 10 maal de KM
(2). Fosfaat remt de activiteit van alkalische fosfatase, en de hoeveelheid fosfaat in serum
verschilt aanzienlijk van persoon tot persoon, en van patiënt tot patiënt. De vraag is of de
aanwezigheid van fosfaat in het serum de enzymbepaling zodanig stoort dat de alkalische
fosfatase waarde onbetrouwbaar wordt voor de diagnostiek. Dat is met name het geval als
fosfaat een non-competitieve remmer is van alkalische fosfatase. Het doel van dit experiment is
1
remmer bij de alkalische fosfatase
activiteit
Voornaam Achternaam (studentennummer)
Samenvatting
De vraagstelling van dit onderzoek is of fosfaat als een competitieve of een non-competitieve
remmer werkt bij het remmen van de alkalische fosfatase activiteit. De probleemstelling bij deze
vraag is dat als fosfaat een non-competitieve remmer is, de enzymbepaling storend bevonden
wordt waardoor de alkalische fosfatase waarde onbetrouwbaar is.
Om dit te kunnen beslissen, wordt productievorming met en zonder de remmer bekeken bij
dezelfde hoeveelheid substraat. In een Lineweaver-Burk plot kan men de verschillen in de
Michaelis-Menten constanten (Km) en de maximale snelheden (Vmax) van de alkalische fosfatase
activiteit zien.
De gevonden meetwaarden van de productievorming met de remmer hebben een Km van 0,2
mmol/L en een Vmax van 140 nmol/min. De gevonden meetwaarden van de productievorming
zonder de remmer hebben een Km van 0,1 mM en een Vmax van 200 nmol/min.
Uit de resultaten wordt de conclusie getrokken dat de alkalische fosfatase activiteit wordt
geremd door een competitieve remmer. Hierdoor zal fosfaat de enzymbepaling niet storen, de
alkalische fosfatase waarde betrouwbaar houden en voor spectrofotometrische bepaling ervan
kunnen worden gebruikt.
Inleiding
Alkalische fosfatase (EC 3.1.3.1) is een enzym dat organische fosfaatesters hydrolyseert. Het in
humaan plasma aanwezige enzym is vooral afkomstig van lever- en galepitheel, en van
osteoblasten (1). De alkalische fosfatase activiteit in plasma is sterk verhoogd in patiënten met
cholestase door galwegobstructie, bij sommige leveraandoeningen en bepaalde
botstofwisselingsziekten. Meting van alkalische fosfatase activiteit in plasma heeft dan ook een
belangrijk rol in de diagnostiek van deze aandoeningen (1).
De spectrofotometrische bepaling van de alkalische fosfatase activiteit is gebaseerd op de
omzetting van het kleurloze p-nitrofenylfosfaat in het geelgekleurde p-nitrofenol. De bepaling
van de hoeveelheid aanwezig enzym vindt plaats onder Vmax condities, hetgeen voor een
Michaelis-Menten enzym betekent bij een substraatconcentratie van minimaal 10 maal de KM
(2). Fosfaat remt de activiteit van alkalische fosfatase, en de hoeveelheid fosfaat in serum
verschilt aanzienlijk van persoon tot persoon, en van patiënt tot patiënt. De vraag is of de
aanwezigheid van fosfaat in het serum de enzymbepaling zodanig stoort dat de alkalische
fosfatase waarde onbetrouwbaar wordt voor de diagnostiek. Dat is met name het geval als
fosfaat een non-competitieve remmer is van alkalische fosfatase. Het doel van dit experiment is
1
