Hoofdstuk 3: analyse van RNA en transcriptomics
Overzicht:
1. Transcriptoomanalyse (transcriptomics)
a. RNA (cDNA) micro-arrays
b. RNA (cDNA) short-read sequencing
c. RNA (cDNA en direct RNA) long-read sequencing
2. Single-cell transcriptomics
3. Spatial transcriptomics
doel: transcript(en) identificeren, genexpressie meten
16
, 1. Transcriptoomanalyse (transcriptomics)
1.1. RNA (cDNA) micro-arrays
RNA van staal wordt omgezet in gemerkt cDNA cDNA wordt gehybridiseerd met array die probes bevat
voor verschillende (alle) genen
cDNA microarrays: probe = 1 lang cDNA molecule (600-2400 nt) of meerdere lange oligont’s (70-
80nt) per gen (long-nucleotide microarray) probe gespot op vaste fase (microarray)
o synthese van probe door PCR, klonering of chemische synthese (daarna robotprinter
spotting van probes op microarray)
o verhouding test vs referentiestaal: verschillend fluorescent label; op 1 microarray (zie
verder bij “two-channel” detectie)
o voordelen: lange transcripten meten
o nadelen: veel input RNA nodig (<-> weinig abundante targets), probes niet altijd
enkelstrengs, cross-linken soms (niet handig om mee te werken)
high-density oligonucleotide microarrays: probe = meerdere korte oligont’s (25-50 nt) per gen.
probe in situ aangemaakt op vaste fase (microarray)
o evt controles: match en mismatch probe (1 nt verschil in midden dus gaat niet binden,
nuttig om achtergrond signaal te meten)
o andere soort probes die kunnen toegevoegd worden:
normalizatie-probes: normaliseren voor systemische bias, voor vergelijken van
microarrays, experimenten,… vgl referentiegenen (HK genes) bij RT-qPCR
corrigeren voor verschillende concentraties RNA in de inputhoeveelheid
replicatie-probes: technische herhalingen, voor reproduceerbaarheid
o synthese van probe op microarray zelf (bv fotolithografie) principe:
lokaal het beschermend laagje weggebrand
op die plaatsen wordt een bepaald nucleotide gebonden bv een T
een nieuw beschermend laagje wordt aangebracht
het proces wordt herhaald voor de andere nucleotiden en ook voor de volgende
baseposities
o reverse transcriptie: totaal RNA cDNA
o in vitro transcriptie: cDNA cRNA (biotine label eraan)
o Vervolgens fragmentatie, hybridizatie en detectie (“one-channel” detectie)
Ontwerp van de probes hangt af van wat je wilt meten: expressie op gen niveau (meerdere exonen),
expressie op exon niveau (hogere resolutie nodig om de exonen apart te bekijken) of expressie meten van
al dan niet alternatieve transcripten (gaat enkel het 3’ uiteinde van het gen meten zonder onderscheid te
maken tussen de transcripten
2 soorten detectie: fluorescentie:
“two-channel” = 2 kleuren (meteen te vergelijken)
o Test- en referentiestaal verschillend gelabeld; op 1 array. Verhouding (ratio) genexpressie
tussen test en referentiestaal (meestal Cy3 en Cy5 gebruikt)
o Voordeel: makkelijke vergelijking tss 2 stalen
o Nadeel: moeilijker voor meerdere stalen of om meerdere arrays te vergelijken
“one-channel” = 1 kleur (bv Affymetrix)
o 1 staal per array, fluorescentie intensiteit, absolutie genexpressie
o Voordeel: meerdere stalen en meerdere arrays vergelijken
Typische plots om te analyse op micro-arrays weer te geven:
Heatmap Vaak gecombineerd met een manier van clustering (dendrogram) = genen en/of stalen
groeperen supervised vs unsupervised clustering
Volcano plot: x-as is verschil in expressie (log2(fold change)) en y-as is stat. significantie
PCA = principal component analysis = a technique used to emphasize variation and bring out strong
patterns in a dataset often used to make data easy to explore and visualize
Classificatie van genen (Gene Ontology)
17
Overzicht:
1. Transcriptoomanalyse (transcriptomics)
a. RNA (cDNA) micro-arrays
b. RNA (cDNA) short-read sequencing
c. RNA (cDNA en direct RNA) long-read sequencing
2. Single-cell transcriptomics
3. Spatial transcriptomics
doel: transcript(en) identificeren, genexpressie meten
16
, 1. Transcriptoomanalyse (transcriptomics)
1.1. RNA (cDNA) micro-arrays
RNA van staal wordt omgezet in gemerkt cDNA cDNA wordt gehybridiseerd met array die probes bevat
voor verschillende (alle) genen
cDNA microarrays: probe = 1 lang cDNA molecule (600-2400 nt) of meerdere lange oligont’s (70-
80nt) per gen (long-nucleotide microarray) probe gespot op vaste fase (microarray)
o synthese van probe door PCR, klonering of chemische synthese (daarna robotprinter
spotting van probes op microarray)
o verhouding test vs referentiestaal: verschillend fluorescent label; op 1 microarray (zie
verder bij “two-channel” detectie)
o voordelen: lange transcripten meten
o nadelen: veel input RNA nodig (<-> weinig abundante targets), probes niet altijd
enkelstrengs, cross-linken soms (niet handig om mee te werken)
high-density oligonucleotide microarrays: probe = meerdere korte oligont’s (25-50 nt) per gen.
probe in situ aangemaakt op vaste fase (microarray)
o evt controles: match en mismatch probe (1 nt verschil in midden dus gaat niet binden,
nuttig om achtergrond signaal te meten)
o andere soort probes die kunnen toegevoegd worden:
normalizatie-probes: normaliseren voor systemische bias, voor vergelijken van
microarrays, experimenten,… vgl referentiegenen (HK genes) bij RT-qPCR
corrigeren voor verschillende concentraties RNA in de inputhoeveelheid
replicatie-probes: technische herhalingen, voor reproduceerbaarheid
o synthese van probe op microarray zelf (bv fotolithografie) principe:
lokaal het beschermend laagje weggebrand
op die plaatsen wordt een bepaald nucleotide gebonden bv een T
een nieuw beschermend laagje wordt aangebracht
het proces wordt herhaald voor de andere nucleotiden en ook voor de volgende
baseposities
o reverse transcriptie: totaal RNA cDNA
o in vitro transcriptie: cDNA cRNA (biotine label eraan)
o Vervolgens fragmentatie, hybridizatie en detectie (“one-channel” detectie)
Ontwerp van de probes hangt af van wat je wilt meten: expressie op gen niveau (meerdere exonen),
expressie op exon niveau (hogere resolutie nodig om de exonen apart te bekijken) of expressie meten van
al dan niet alternatieve transcripten (gaat enkel het 3’ uiteinde van het gen meten zonder onderscheid te
maken tussen de transcripten
2 soorten detectie: fluorescentie:
“two-channel” = 2 kleuren (meteen te vergelijken)
o Test- en referentiestaal verschillend gelabeld; op 1 array. Verhouding (ratio) genexpressie
tussen test en referentiestaal (meestal Cy3 en Cy5 gebruikt)
o Voordeel: makkelijke vergelijking tss 2 stalen
o Nadeel: moeilijker voor meerdere stalen of om meerdere arrays te vergelijken
“one-channel” = 1 kleur (bv Affymetrix)
o 1 staal per array, fluorescentie intensiteit, absolutie genexpressie
o Voordeel: meerdere stalen en meerdere arrays vergelijken
Typische plots om te analyse op micro-arrays weer te geven:
Heatmap Vaak gecombineerd met een manier van clustering (dendrogram) = genen en/of stalen
groeperen supervised vs unsupervised clustering
Volcano plot: x-as is verschil in expressie (log2(fold change)) en y-as is stat. significantie
PCA = principal component analysis = a technique used to emphasize variation and bring out strong
patterns in a dataset often used to make data easy to explore and visualize
Classificatie van genen (Gene Ontology)
17
