Biochemie: Hoofdstuk 29
Dia 1
Synthese van RNA, + modificaties aan RNA
DIA 2
Schema hoe splicing optreedt
Dia 3
1. Opslaan genetische info kan zowel door RNA als door DNA, evolutionair gezien was RNA
eerst,
o DNA is een soort verbeterde versie, want stabieler en kan langer bewaard blijven.
o Houdt verband hiermee:
Onder andere door de 2’ deoxyribose ipv ribose
Selectief afbreken van RNA in aanwezigheid van DNA
Fouten die gerepareerd kunnen worden, zoals deaminaties van de C die bij
DNA kan hersteld worden dankzij een thymine base in DNA, zo kan
onderscheid gemaakt worden tussen een gedeamineerde C die een U
geworden is, en dan de bouwsteen in DNA T, in RNA is dit een U, daar zit je
met een probleem dat je geen onderscheid kan maken tussen een U die van
een gedeanimeerde C afkomstig is, of oorspronkelijk van een U afkomstig is
2. Normale stroom van info, centrale tochma van de moleculaire biologie, geformuleerd door
kriek in 1956, stelde dat DNA gerepliceerd kan worden, getranscribeerd worden naar RNA,
RNA kan getranslateerd worden naar proteïnen
3. RNA – synthese: volgt zelfde principes als polynucleotide synthese
4. Modificatie van RNA
5. In prokaryoten
o Initiatie
o Verlenging RNA-keten
o Terminatie
6. Eukaryoten
o Bij prokaryoten 1 RNA-polymerase die alle RNA-synthese gaat doen
o Bij eukaryoten meer specialisatie 3 soorten, I, II en III
o Transcriptiefactoren = eiwitten die in staat zijn om bepaalde sequenties te
herkennen in het DNA om dan overgaan tot de transcriptie
o Belangrijk want, in veel gevallen wordt de genexpressie geregeld op niveau van
transcriptie Gen dat meer tot expressie komt bevat dus meestal meer RNA in de
cel
o Enhancer sequenties zorgen dat promotors meer efficiënt gebruikt worden
1
,Dia 4
1. In eukaryoten (vervolg vorige dia)
Primaire transcripten
o = de RNA- sequentie, het RNA- molecule zoals het gesynthetiseerd is door de RNA-
polymerase, de nucleotiden aan elkaar gezet
RNA-polymerase II
o Aan 5’uiteinde wordt deze gecapt, worden voorzien van een speciale structuur
o polyA-staart kan toegevoegd worden na transcriptie
o splicing
aaneenzetten van exonen
spliceosomen grote samengestelde structuren samengesteld uit RNA
component en proteïne component
snRNP structuren waar dit zal gebeuren, kleine RNA-moleculen
afkomstig van RNA-polymerase II, hebben als taak: herkennen van
welbepaalde sequenties om splicing op de juiste plaats en de juiste manier te
kunnen laten gebeuren. Het is een sequentie die toelaat om de overgangen
te herkennen tussen exonen en intronen en bepaalde structuren in de
intronen zoals de branch-site.
15% aandoeningen door mutaties bij splicing
o Zo kan de splicing site verloren gaan of kan er een plaats gespliced worden die niet
gespliced moet worden
Zelfde pre-mRNA kan verschillend gespliced worden
o Zo is er meer variatie
o Verschillende celtypes iedere cel op zijn eigen manier
o Stadia kan verschillend zijn
o Na infectie door pathogeen kan bv ander splice patroon vertonen als reactie op de
infectie, of door verandering in omgeving, of intern in de cel
Na capping en toevoeging poly-A staart, ook RNA-editing (= andere wijzigingen aan het DNA)
Men dacht oorspronkelijk dat er veel meer genen waren, vertrekkend uit 1 en hetzelfde DNA
dat RNA’s gaat produceren die op verschillende manieren kunnen splicen waardoor je meer
diversiteit en proteïnen hebt, veel meer dan men op basis van het aantal genen zou
verwachten.
DIA 5
SPlicing (schematisch voorgesteld)
Blauw = eerste exon
Rood = 2de extron
Geel = intron
Exonen worden aan elkaar gevlochten (splicing) terwijl de intronen vertrekken onder de
vorm van een lasso
DIA 6
Omzetting gebeurt 1 op 1
Tegenover een nucleotide in DNA komt een nucleotide in RNA
2
, Manier van werken, 1 van de sleutelelementen = het voorkomen van metaalionen
( vergelijkbaar met DNA-polymerasen mg 2+), kunnen ook werken in aanwezigheid van
mangaan2+ in het labo
DIA 7
Beeld van die verschillende polymerasen
Prokaryoot vs eukaryoot
Algemene vorm = vergelijkbaar
Ook met inham waar DNA zal vastgehouden worden
Katalytische site voorgesteld door groene bol
DIA 8
Links RNA-polymerase van thermus aquaticus (gebruikt bij PCR) en rechts van bakkersgist
Katalytische site aangeduid
DIA 9
Stappen van polymerisatie reacties
Bv bij het maken van polycereen
Terminatie = het afsluiten van de reactie
DIA 10
1. Zoeken naar plaatsen waar initiatie zou moeten optreden
a. Bij E. coli, +/- 2000 promoter sites per 4,8 miljoen basenparen
b. Structuren die daar voorkomen bevinden zich op het DNA, = cis-acting elements, de
sequenties bevinden zich op de zelfde streng als de genen die getranscribeerd
moeten worden.
2. Kort deel helicaal DNA moet ontwonden worden om informatie te kunnen lezen
3. Correcte complementaire nucleotide moet toegevoegd worden, dit gebeurt telkens opnieuw
zodat RNA-polymerase zich over DNA beweegt. (elongatie)
a. Processief: 1 keer dat het polymerase zich geïnstalleerd heeft op het DNA blijft het
bouwstenen toevoegen
b. Distributieve enzymen: enzymen die telkens moeten loskomen en opnieuw hun
substraat moeten vinden en binden
c. Heel efficiënt
4. Overgang op terminatie
5. Interactie ..
a. Trans-acting factors = van buitenaf, niet vervat in sequentie DNA, gaan bepaalde
sequenties kunnen herkennen, kunnen mate waarin initiatie gaat optreden
moduleren, gaan een veel belangrijkere rol spelen bij eukaryoten
b. Is een eiwit heel sterk tot expressie gebracht? Dan zal men meestal veel van die RNA-
transcripten terug vinden.
3
, DIA 11
Reactie als dusdanig, hoe zal RNA-polymerase in ze werk gaan?
Bij prokaryote : 1 RNA-polymerase die het werk doet
Bij E.coli
400 kilodalton groot
Sigma -subunit
Zoekt promotor, helpt bij initiatie, komt vervolgens los,
Dan kan het RNA-polymerase ze werk verder zetten
Core-enzyme
Staat in voor katalytische activiteit
Ontstaan uit een convergente evolutie
Zochten allebei een oplossing en allebei gevonden
Nucleoside trifosfaat = het bouwsteen dat toegevoegd gaat worden
2de magnesium gaat verdwijnen met PPi = de leaving groep van de reactie
Tegenstelling bij DNA-polymerase, 2 aspartaten die het magnesium vasthouden zodanig dat
ze gefixeerd zijn in de ruimte
Hier komen 3 aspartaten tussen
DIA 12
De sub-units die voorkomen
Alpha 2X , beta en beta accent, Samen stellen het core-enzyme voor
Sigma sub-unit Zoekt de promotors
Omega sub unit: bestaat nog discussie rond
DIA 13
Schematisch overzicht van hoe een prokaryoot RNA-polymerase gevormd gaat worden
Alpha, alpha, beta alpha 2 beta complex
Omega + beta accent gaat binden aan beta accent gaat conformationele veranderingen
doorvoeren zodanig dat beta accent makkelijker geïncorporeerd gaat worden in het complex
Core-enzyme inclusief omega sub-unit
En dan zal sigma sub-unit bij de inititatie toegevoegd worden/ gebonden worden in de
vorming van een holo-enzym in die vorm gaat initiatie optreden, waarbij sigma sub-unit
opzoek gaat naar de promotor
DIA 14
Detailopname van de katalytische site waar de RNA keten gaat groeien
Groeiende RNA-keten (met het base gedeelte) gaat om een uracil base
Piriminine ring (6ring) met stikstof 1, koolstof in 2 met de carbonyl dus dubbel gebonden aan
de zuurstof, stikstof in pos. 3, koolstof dubbel gebonden aan zuurstof (zo weet je dat je te
maken hebt met een uracil als base)
4
Dia 1
Synthese van RNA, + modificaties aan RNA
DIA 2
Schema hoe splicing optreedt
Dia 3
1. Opslaan genetische info kan zowel door RNA als door DNA, evolutionair gezien was RNA
eerst,
o DNA is een soort verbeterde versie, want stabieler en kan langer bewaard blijven.
o Houdt verband hiermee:
Onder andere door de 2’ deoxyribose ipv ribose
Selectief afbreken van RNA in aanwezigheid van DNA
Fouten die gerepareerd kunnen worden, zoals deaminaties van de C die bij
DNA kan hersteld worden dankzij een thymine base in DNA, zo kan
onderscheid gemaakt worden tussen een gedeamineerde C die een U
geworden is, en dan de bouwsteen in DNA T, in RNA is dit een U, daar zit je
met een probleem dat je geen onderscheid kan maken tussen een U die van
een gedeanimeerde C afkomstig is, of oorspronkelijk van een U afkomstig is
2. Normale stroom van info, centrale tochma van de moleculaire biologie, geformuleerd door
kriek in 1956, stelde dat DNA gerepliceerd kan worden, getranscribeerd worden naar RNA,
RNA kan getranslateerd worden naar proteïnen
3. RNA – synthese: volgt zelfde principes als polynucleotide synthese
4. Modificatie van RNA
5. In prokaryoten
o Initiatie
o Verlenging RNA-keten
o Terminatie
6. Eukaryoten
o Bij prokaryoten 1 RNA-polymerase die alle RNA-synthese gaat doen
o Bij eukaryoten meer specialisatie 3 soorten, I, II en III
o Transcriptiefactoren = eiwitten die in staat zijn om bepaalde sequenties te
herkennen in het DNA om dan overgaan tot de transcriptie
o Belangrijk want, in veel gevallen wordt de genexpressie geregeld op niveau van
transcriptie Gen dat meer tot expressie komt bevat dus meestal meer RNA in de
cel
o Enhancer sequenties zorgen dat promotors meer efficiënt gebruikt worden
1
,Dia 4
1. In eukaryoten (vervolg vorige dia)
Primaire transcripten
o = de RNA- sequentie, het RNA- molecule zoals het gesynthetiseerd is door de RNA-
polymerase, de nucleotiden aan elkaar gezet
RNA-polymerase II
o Aan 5’uiteinde wordt deze gecapt, worden voorzien van een speciale structuur
o polyA-staart kan toegevoegd worden na transcriptie
o splicing
aaneenzetten van exonen
spliceosomen grote samengestelde structuren samengesteld uit RNA
component en proteïne component
snRNP structuren waar dit zal gebeuren, kleine RNA-moleculen
afkomstig van RNA-polymerase II, hebben als taak: herkennen van
welbepaalde sequenties om splicing op de juiste plaats en de juiste manier te
kunnen laten gebeuren. Het is een sequentie die toelaat om de overgangen
te herkennen tussen exonen en intronen en bepaalde structuren in de
intronen zoals de branch-site.
15% aandoeningen door mutaties bij splicing
o Zo kan de splicing site verloren gaan of kan er een plaats gespliced worden die niet
gespliced moet worden
Zelfde pre-mRNA kan verschillend gespliced worden
o Zo is er meer variatie
o Verschillende celtypes iedere cel op zijn eigen manier
o Stadia kan verschillend zijn
o Na infectie door pathogeen kan bv ander splice patroon vertonen als reactie op de
infectie, of door verandering in omgeving, of intern in de cel
Na capping en toevoeging poly-A staart, ook RNA-editing (= andere wijzigingen aan het DNA)
Men dacht oorspronkelijk dat er veel meer genen waren, vertrekkend uit 1 en hetzelfde DNA
dat RNA’s gaat produceren die op verschillende manieren kunnen splicen waardoor je meer
diversiteit en proteïnen hebt, veel meer dan men op basis van het aantal genen zou
verwachten.
DIA 5
SPlicing (schematisch voorgesteld)
Blauw = eerste exon
Rood = 2de extron
Geel = intron
Exonen worden aan elkaar gevlochten (splicing) terwijl de intronen vertrekken onder de
vorm van een lasso
DIA 6
Omzetting gebeurt 1 op 1
Tegenover een nucleotide in DNA komt een nucleotide in RNA
2
, Manier van werken, 1 van de sleutelelementen = het voorkomen van metaalionen
( vergelijkbaar met DNA-polymerasen mg 2+), kunnen ook werken in aanwezigheid van
mangaan2+ in het labo
DIA 7
Beeld van die verschillende polymerasen
Prokaryoot vs eukaryoot
Algemene vorm = vergelijkbaar
Ook met inham waar DNA zal vastgehouden worden
Katalytische site voorgesteld door groene bol
DIA 8
Links RNA-polymerase van thermus aquaticus (gebruikt bij PCR) en rechts van bakkersgist
Katalytische site aangeduid
DIA 9
Stappen van polymerisatie reacties
Bv bij het maken van polycereen
Terminatie = het afsluiten van de reactie
DIA 10
1. Zoeken naar plaatsen waar initiatie zou moeten optreden
a. Bij E. coli, +/- 2000 promoter sites per 4,8 miljoen basenparen
b. Structuren die daar voorkomen bevinden zich op het DNA, = cis-acting elements, de
sequenties bevinden zich op de zelfde streng als de genen die getranscribeerd
moeten worden.
2. Kort deel helicaal DNA moet ontwonden worden om informatie te kunnen lezen
3. Correcte complementaire nucleotide moet toegevoegd worden, dit gebeurt telkens opnieuw
zodat RNA-polymerase zich over DNA beweegt. (elongatie)
a. Processief: 1 keer dat het polymerase zich geïnstalleerd heeft op het DNA blijft het
bouwstenen toevoegen
b. Distributieve enzymen: enzymen die telkens moeten loskomen en opnieuw hun
substraat moeten vinden en binden
c. Heel efficiënt
4. Overgang op terminatie
5. Interactie ..
a. Trans-acting factors = van buitenaf, niet vervat in sequentie DNA, gaan bepaalde
sequenties kunnen herkennen, kunnen mate waarin initiatie gaat optreden
moduleren, gaan een veel belangrijkere rol spelen bij eukaryoten
b. Is een eiwit heel sterk tot expressie gebracht? Dan zal men meestal veel van die RNA-
transcripten terug vinden.
3
, DIA 11
Reactie als dusdanig, hoe zal RNA-polymerase in ze werk gaan?
Bij prokaryote : 1 RNA-polymerase die het werk doet
Bij E.coli
400 kilodalton groot
Sigma -subunit
Zoekt promotor, helpt bij initiatie, komt vervolgens los,
Dan kan het RNA-polymerase ze werk verder zetten
Core-enzyme
Staat in voor katalytische activiteit
Ontstaan uit een convergente evolutie
Zochten allebei een oplossing en allebei gevonden
Nucleoside trifosfaat = het bouwsteen dat toegevoegd gaat worden
2de magnesium gaat verdwijnen met PPi = de leaving groep van de reactie
Tegenstelling bij DNA-polymerase, 2 aspartaten die het magnesium vasthouden zodanig dat
ze gefixeerd zijn in de ruimte
Hier komen 3 aspartaten tussen
DIA 12
De sub-units die voorkomen
Alpha 2X , beta en beta accent, Samen stellen het core-enzyme voor
Sigma sub-unit Zoekt de promotors
Omega sub unit: bestaat nog discussie rond
DIA 13
Schematisch overzicht van hoe een prokaryoot RNA-polymerase gevormd gaat worden
Alpha, alpha, beta alpha 2 beta complex
Omega + beta accent gaat binden aan beta accent gaat conformationele veranderingen
doorvoeren zodanig dat beta accent makkelijker geïncorporeerd gaat worden in het complex
Core-enzyme inclusief omega sub-unit
En dan zal sigma sub-unit bij de inititatie toegevoegd worden/ gebonden worden in de
vorming van een holo-enzym in die vorm gaat initiatie optreden, waarbij sigma sub-unit
opzoek gaat naar de promotor
DIA 14
Detailopname van de katalytische site waar de RNA keten gaat groeien
Groeiende RNA-keten (met het base gedeelte) gaat om een uracil base
Piriminine ring (6ring) met stikstof 1, koolstof in 2 met de carbonyl dus dubbel gebonden aan
de zuurstof, stikstof in pos. 3, koolstof dubbel gebonden aan zuurstof (zo weet je dat je te
maken hebt met een uracil als base)
4
