Workshop microscopie review
● Met de lichtmicroscopie kun je gekleurde preparaten
bekijken e.g. cellen/weefsel of de enzymactiviteit en de
lokalisatie ervan d.m.v. antilichamen
● Preparaten worden met wit licht bekeken zodat het
kleurecht is → wit licht is opgebouwd uit een spectrum
van UV tot infrarood
● UV licht heeft veel energie maar een korte golflengte
● Infrarood heeft weinig energie maar een lange
golflengte
● Resolutie = de afstand tussen 2 punten waarbij je
die kan onderscheiden van elkaar → hoe kleiner,
hoe beter de resolutie!
● De resolutie van een lichtmicroscoop = 1/10 μm
● De resolutie van een SEM = 1^-5 nm
● De resolutie van een TEM = 0.1 nm
−−> 𝑐 * Ω / 𝑁𝐴
c = constante (=o.6)
Ω= de golflengte
NA = numerical aperture (deze staat op de objectief)
● Hoe groter de numerical aperture, hoe beter → een
NA van 1 is eigenlijk heel goed!
● Aberration correction = wanneer er binnen in de lens
nog meerdere lenzen zitten die het beeld focussen
naar een punt → hoe groter de vergroting, hoe meer tussen lenzen er aanwezig
zijn en hoe hoger de NA
, ● De fluoroscentiemicroscoop kun je gebruiken om immunostainings en tags te
bekijken → hierbij geldt: hoe dunner de coupe, hoe beter de details
● Bij een directe kleuring zit het antilichaam primair gebonden aan de epitope
● Bij een indirecte kleuring maak je gebruik van een secundaire antilichaam die
bindt aan de epitope
● Rood, groen en blauw vormen samen wit licht!
● Groen = alexa 488
● Blauw = alexa 644
● Rood = alexa 568 → zijn chemische moleculen die het
preparaat diep doordringen en die dan gaan fluoresceren
● Bij een fading, doft de fluorescentie uit waardoor je het
niet meer kan zien
● Fluorescentie komt tot stand doordat energie (excitatie) terugvalt en het
spectrum dan verschuift waardoor andere licht wordt uitgezonden (emissie)
● Bij fluorescentie microscopen heb je een lichtbron nodig, wat dan pieken van licht
uitstraalt e.g. HBO /XBO
● Het licht gaat dan door de excitatie filter, wat dan bepaald welke excitatie licht
wordt uitgezonden en gaat dan door de emissie filter
● Met de lichtmicroscopie kun je gekleurde preparaten
bekijken e.g. cellen/weefsel of de enzymactiviteit en de
lokalisatie ervan d.m.v. antilichamen
● Preparaten worden met wit licht bekeken zodat het
kleurecht is → wit licht is opgebouwd uit een spectrum
van UV tot infrarood
● UV licht heeft veel energie maar een korte golflengte
● Infrarood heeft weinig energie maar een lange
golflengte
● Resolutie = de afstand tussen 2 punten waarbij je
die kan onderscheiden van elkaar → hoe kleiner,
hoe beter de resolutie!
● De resolutie van een lichtmicroscoop = 1/10 μm
● De resolutie van een SEM = 1^-5 nm
● De resolutie van een TEM = 0.1 nm
−−> 𝑐 * Ω / 𝑁𝐴
c = constante (=o.6)
Ω= de golflengte
NA = numerical aperture (deze staat op de objectief)
● Hoe groter de numerical aperture, hoe beter → een
NA van 1 is eigenlijk heel goed!
● Aberration correction = wanneer er binnen in de lens
nog meerdere lenzen zitten die het beeld focussen
naar een punt → hoe groter de vergroting, hoe meer tussen lenzen er aanwezig
zijn en hoe hoger de NA
, ● De fluoroscentiemicroscoop kun je gebruiken om immunostainings en tags te
bekijken → hierbij geldt: hoe dunner de coupe, hoe beter de details
● Bij een directe kleuring zit het antilichaam primair gebonden aan de epitope
● Bij een indirecte kleuring maak je gebruik van een secundaire antilichaam die
bindt aan de epitope
● Rood, groen en blauw vormen samen wit licht!
● Groen = alexa 488
● Blauw = alexa 644
● Rood = alexa 568 → zijn chemische moleculen die het
preparaat diep doordringen en die dan gaan fluoresceren
● Bij een fading, doft de fluorescentie uit waardoor je het
niet meer kan zien
● Fluorescentie komt tot stand doordat energie (excitatie) terugvalt en het
spectrum dan verschuift waardoor andere licht wordt uitgezonden (emissie)
● Bij fluorescentie microscopen heb je een lichtbron nodig, wat dan pieken van licht
uitstraalt e.g. HBO /XBO
● Het licht gaat dan door de excitatie filter, wat dan bepaald welke excitatie licht
wordt uitgezonden en gaat dan door de emissie filter
