Samenvatting Moleculaire Genetica En Epigenetica

ZSO 2: Bibliotheken (genomisch, chromosomaal,cDNA)

Analyseren en manipuleren DNA

 Vroeger DNA moeilijkste biologische structuur te bestuderen
 Vandaag de makkelijkste
-> hele gnoom van bacteriën en fungi te weten in uren
-> hele gnoom van mensen in minder dan dag
 Nucleotide genoom gekend -> individuele
 genen makkelijk te isoleren en produceren d.m.v. cloning in bacteriale of dierlijke cellen of
door synthese in vitro
-> kleine hoeveelheden proteïnen en RNA omzetten naar grote voor analyse
 Manipuleren van DNA in proefbuis of een organisme = Recombinant DNA technologie
 Meerdere manipulaties:
o Splijten van DNA op bepaalde sites door restrictie nucleases -> isolering en
manipulatie van individuele stukken genoom
o DNA ligatie -> DNA van andere bronnen aan elkaar maken
o DNA cloning (cloning vectors of polymerase chain reaction) -> deel van genoom
geïsoleerd en vermenigvuldigd
o Nucleïnezuur hybridisatie -> identificeren van DNA/RNA met veel precisie door
eigenschap binden van bepaald Nucleïnezuur sequentie
o DNA synthese -> chemische syntiseren van elke DNA sequentie natuurlijk of niet
o Snelle afbraak van nucleotiden sequenties van DNA/RNA

Gezuiverde DNA moleculen kunnen speciaal gelabeld worden met radio-isotopen of
chemische markers in vitro

 DNA polymerase dat synthiseert en repareert DNA -> belangrijk voor manipuleren
DNA
-> doordat polymerase complementaire sequenties maakt van bestaande
-> in proefbuis ook met gemodificeerde nucleotiden
 Polymerase krijgt een template samen met precursor dat modificatie bevat
-> polymerase kan beginnen met precursor => “kopieën” maken van template
 DNA gelabeld met radio-isotoop -> gedetecteerd na gel elektroforese door gel voor
fotografische film te plaatsen
 Maar ook door scanning met detector voor radio emisie

Genen kunnen gekloneerd worden door bacteriën

 Elke DNA fragment kan gekloneerd worden
 DNA cloning heeft 2 termen:
o Meerdere identieke kopieën maken van DNA moleculen
o Isolatie van bepaalde lengte van DNA van de rest van genoom
-> zelfde term want 2 kan niet zonder 1
 DNA cloning op meerdere manieren:
o DNA fragment in gezuiverd DNA genoom steken van een
zelfvermenigvuldigend genetisch element -> een plasmide

,  Plasmide vectoren zijn klein, circulaire moleculen met dubbele strengen DNA
afkomstig van plasmide (van bacteriën)
 Plasmide is klein deel van bacterieel DNA -> makkelijk te isoleren
 Plasmide eerst opengesneden door restrictie nuclease zodat er enkelstrengig DNA
gevormd wordt -> DNA voor klonering aan opening toegevoegd met DNA ligase
 (DNA ligase maakt Okazaki fragmenten aan elkaar bij DNA replicatie)
 Plasmide wordt dan terug in bacterie gestopt die dan gaat vermenigvuldigen samen
met het DNA -> vele kopieën van DNA
 Bacterie lyseert -> DNA isoleert -> nodig DNA uit plasmide snijden door zelfde
restrictie enzym -> nodig DNA afscheiden van ander DNA door gel elektroforese
 Dit allemaal kan elke DNA sequentie vermenigvuldigen en zuiveren
 Meest voorkomende plasmide vector = F plasmide van E. coli
 F plasmide en bacteriële artificiële chromosoom (BAC) zijn maar in 1 of 2 kopieën
aanwezig in bacterie -> stabiel héél lange DNA sequenties behouden
-> zo kan DNA niet snel door elkaar gehaald worden door recombinantie
 BAC meeste gebruikte vector

Een heel genoom kan gepresenteerd worden in DNA bibliotheek

 Handig om genoom kapot te maken en elke fragment te kloneren via plasmide
vectoren
 DNA bibliotheek = collectie van gekloneerde plasmide moleculen
 Genetische bibliotheek = DNA fragmenten afkomstig van chromosomaal DNA van
gewild organisme
 Andere wijze: kloneren van DNA omgezet in mRNA
-> mRNA uit cel halen en DNA kopieën ervan maken = complementaire DNA of cDNA
 Van mRNA naar cDNA door reverse transcriptase
-> enzym maakt enkelstrengig complementaire cDNA streng van RNA streng
 cDNA streng wordt dubbelstreng door DNA polymerase -> dubbelstreng in vector
voor klonering
 Dit maakt een cDNA bibliotheek met allemaal cDNA klonen

Genomisch en cDNA bibliotheken hebben verschillende voor- en nadelen

 Genomische bibliotheken handig voor bepalen van nucleotide sequentie van
compleet genoom
 cDNA klonen hebben een ononderbroken sequentie van gen, genomische klonen wel
onderbroken

Hybridisatie geeft een krachtige, maar simpele weg om specifieke nucleotide sequenties te
detecteren

 DNA dubbelhelix aan elkaar gehouden door waterstofbruggen
 DNA denaturatie = waterstofbruggen breken
-> dubbelstreng worden 2 enkelstrengen
 Denaturatie door verhitting tot 90° van DNA

,  Hybridisatie/renaturatie = temperatuur terug verlagen -> strengen komen terug bij
elkaar
 Probes = enkelstrengig +- 30 nucleotiden lang DNA molecule, chemisch gesynthiseerd
 Probes zijn complementair aan gewilde DNA sequentie -> gaan erop zitten
 Gelabelde probes zijn zichtbaar

Genfunctie

 Genen coderen voor enzymatische en niet-enzymatische proteïnen
 Genen werken niet in isolatie maar samen met andere genen voor goede celwerking

Genetisch gebaseerde enzymen tekortkomingen in mensen

 Genetische ziektes door 1 genmutatie veranderd functie van enzym in pathway
 Enzym tekortkoming door genmutatie:
o Simpel effect
o Pleiotrofisch effect (meerdere verschillende effecten)
 Elke chromosoom korte arm, p, en een lange arm, q
 Elke arm ook onderverdeeld in regio’s en subregio’s
 Ziektes:
o Phenylketonuria (PKU):
 Mutatie in gen voor phenylalanine hydroxylase, enzym dat
aminozuur phenylalanine omzet in aminozuur tyrosine
 phenylalanine nodig voor proteïnen produceren, maar grote
hoeveelheden schadelijk -> omzetten naar tyrosine
o Albinisme:
 Mutatie in gen voor tyrosinase
 Tyrosinase = enzym dat tyrosine omzet in DOPA -> zorgt voor
melanine
o Kartagener syndroom:
 Mutatie in gen voor dyneïne motoren van flagella en cilia
o Tay-Sachs ziektes:
 Mutatie in gen voor lysosomen
 Lysosomen membraangebonden organellen dat 40 soorten enzymen
bevat voor afbraak aminozuren, proteïnen…

Gencontrole van proteïnestructuur

 Meeste enzymen zijn proteïnen, maar niet alle proteïnen zijn enzymen
 Niet-enzymatische proteïnen meer aanwezig dan enzymen
 Ziektes:
o Sikkelcel anemie:
 Genetische ziekte dat effect heeft op hemoglobine
 RBC minder flexiebel -> verstoppen bloedvaten
o Andere hemoglobine mutanten:
 200 soorten