Samenvatting Theorie voor de Praktijk Immunologie
Les 1; Introduction to cell culture of DO11.10 and L929 cells
Cellen worden onderhouden in steriele omgeving (in
vitro).
- Besmetting = ongewenste invloed op je cellen
Cellijnen kunnen onderverdelled worden in
- Hechtende cellijnen
- Suspensie cellijnen
Medium = vloeistof waar cellen in groeien
- Glucose = energiebron
- Aminozuren
- Vitamines
- Antibiotica
- pH-indicator (fenol rood)
- Inorganische zouten = osmose regulatie
- Serum
- FCS (Fetal Calf Serum)
- Bron van groeifactoren, hormonen, mineralen en lipiden
- Belangrijk voor hechting van cellen
Vers toegevoegd aan het medium wordt:
- Aminozuren = Glutamine
- Antibiotica = penicilline/streptomycine
- Serum = tussen de 2,5% en de 10%
Passeren/doorzetten van cellen
- Volle laag cellen = monolayer of 100% confluent
- Vertelt wat over de groeifase van de cellen
Om hechtende cellen los te maken kunnen er 2 methodes gebruikt worden
- Schrapen (RAW-cellen)
- Trypsine (L929)
Je kunt cellen bijvoorbeeld 1:5 of 1:10 doorzetten. De berekeningen voor hechtende cellen
en suspensie cellen gaat wel iets anders:
- Hechtend = eerst cellen los maken door 1 mL trypsine toe te voegen en deze voor 20
seconde te
incuberen. daarna wordt 4 mL medium toegevoegd om het effect van trypsine op te heffen.
Nu is je
volume 5 mL
Wanneer we de oppervlakte dus 10x vergroten breng je dus 0,5 mL van dit mengsel over
in een
nieuwe fles waar al 9,5 mL nieuw medium zit
- Suspensie = de cellen zitten al in het medium, dus wanneer deze cellen worden doorgezet
kan van deze fles (10 mL volume) 1 mL gepakt worden en overgebracht worden in een
nieuwe flask, waar al 9 mL nieuw medium zit.
,Overige aandachtspunten:
- Vloeistoffen/medium worden eerst opgewarmd in een waterbad van 37 °C
- Spullen die je gebruikt wordt eerst gedesinfecteerd met 70% ethanol, je eigen handen
desinfecteer
je door ze eerst te wassen met zeep en daarna met sterilium
- Check of je alle spullen hebt voordat je begint met doorzetten. Anders moet je het pakken
en
opnieuw desinfecteren
- Controleer elke les je cellen onder de microscoop om te kijken naar de dichtbegroeiing en
of er
mogelijk contaminatie heeft plaatsgevonden
Cellen tellen
Cellen kunnen op 2 manieren geteld worden
- Telkamer (Fuchs Rosenthal/Burker Turk)
- Automatische celteller
Bij beide methodes wordt 1:1 verdund met Trypan Blue → dus even veel volume van beide
(sample en Trypan Blue), je verdunningsfactor is dan dus 2
- Vervolgens worden de kleurloze cellen geteld
- Blauwe cellen zijn de dode cellen
Formule om het aantal cellen/mL te berekenen met de telkamer
𝑁 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛
𝐶𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛/𝑚𝐿 = × 103 × 2
(16 × 0,25 × 0,25 × 0,2)
Voorbeeldberekening:
- In 16 vakjes worden 100 cellen geteld
- Deze Formule wordt gebruikt om het aantal cellen/mL te berekenen
𝑁 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛
𝐶𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛/𝑚𝐿 = × 103 × 2
(16 × 0,25 × 0,25 × 0,2)
− Deze kan vereenvoudigd worden op de volgende manier:
𝑁 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛
𝐶𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛/𝑚𝐿 = × 103 × 2
(0,2)
𝐶𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛/𝑚𝐿 = 𝑁 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛 × 104
Dus nu hoeven we alleen maar 100 cellen in te vullen bij N en dit te vermenigvuldigen met
104. In totaal zijn dat 1.106 cellen/mL
𝐶𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛/𝑚𝐿 = 𝑁 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛 × 104
𝐶𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛/𝑚𝐿 = 100 × 104
𝐶𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛/𝑚𝐿 = 1.000.000
Automatische cellenteller
- Slides die na gebruik weggegooid kunnen worden
- In de machine invoeren
- resultaten aflezen
,Les 2; Flow cytometrie DO11.10 cellen
Flow cytometrie = cel voor cel analyseren;
30.000/40.000 cellen/seconden
Doormiddel van lasers gericht op de cellen
- Meet licht verstrooiing (Forward en Side Scatter)
- Fluorescentie (meten op individuele celbasis)
1) Celsuspensie wordt opgenomen door een flowtip
2) Hydrodynamische focusing in de flowchamer (laat
de cellen een voor een door de laser)
Interrogation point = cellen gaan één voor één langs
de laser en worden geananlyseerd
FSC
- Licht wordt verstrooid en valt op een detector achter de laser (detector zit achter de
lichtstraal)
- Meet de grootte van de cel
- Afhankelijk van de celgrootte hoe ver het licht verstrooid wordt, en hoe groter de piek dus
wordt
SSC
- In een hoek van 90 graden aangestraald van de zijkant
- Meet de complexiteit van de cel (gesegmenteerde kern, veel granula of niet)
- Licht wordt verstrooid in alle kanten en wordt dus gemeten in een hoek van 90 graden.
Granula buigen deze lichtstralen, hoe meer deze aanwezig izjn hoe meer lichtbuigingen er
zullen zijn
Licht wordt verstrooid en valt op een detector achter de laser = FSC (Forward Scatter)
En het licht wordt naar de zijkanten verstrooid = SSC (Side Scatter)
, Dot-plot
Resultaten; FSC-SSC dot plots
- Density plots
- De kleuren geven de hoeveelheid aan
SSC (Side Scatter)
(populaties)
- Makkelijk cellen van elkaar
onderscheiden
- Granulocyten (heel complex, dus hoog
in de grafiek te vinden)
- Lymfocyten (klein en beetje complex)
- Monocyten (complex maar wat kleiner)
- Dode cellen (dood, dus weinig
compliciteit en kleinst, resten)
FSC (Forward Scatter)
Fluorescentie
- Fluorescentie = Bepaalde golflengte van licht
- Excitatie = emissie van elektronen
- Bij het aanstralen van fluorforen, zullen ze een bepaald fluorlicht uitstralen
- Er zijn verschillende fluorforen met verschillende excitatie/emissie golflengte (zorgen dat je
niet te
veel overlap hebt met deze verschillende golflengtes)
- Fluorforen koppelen aan specifieke antilichamen.
- Zijn er veel antilichamen aanwezig dan is er een hoge fluorescentie.
- T-cellen hebben een hoge waarde, want hier zijn veel antilichamen aanwezig
- De verschillende fluorforen worden gemeten door verschillende kanalen (verschillende
categorieën
(1 tm 4))
- Kanaal 1 = groen (530 nm)
- Kanaal 2 = oranje/geel (580 nm)
- Kanaal 3 en 4: rood (boven de 600 nm)
Longpastfilter: laat licht boven een bepaalde nm door
shortpasfilter: onder een bepaalde nm licht doorlaten
bandpassfilter: laat licht tussen verschillende nm door
Blauwe laser: FL 1 en FL 2 mee aanstralen (kanaal 1
en 2)
Excitatie 488 nm gericht op cellen
Les 1; Introduction to cell culture of DO11.10 and L929 cells
Cellen worden onderhouden in steriele omgeving (in
vitro).
- Besmetting = ongewenste invloed op je cellen
Cellijnen kunnen onderverdelled worden in
- Hechtende cellijnen
- Suspensie cellijnen
Medium = vloeistof waar cellen in groeien
- Glucose = energiebron
- Aminozuren
- Vitamines
- Antibiotica
- pH-indicator (fenol rood)
- Inorganische zouten = osmose regulatie
- Serum
- FCS (Fetal Calf Serum)
- Bron van groeifactoren, hormonen, mineralen en lipiden
- Belangrijk voor hechting van cellen
Vers toegevoegd aan het medium wordt:
- Aminozuren = Glutamine
- Antibiotica = penicilline/streptomycine
- Serum = tussen de 2,5% en de 10%
Passeren/doorzetten van cellen
- Volle laag cellen = monolayer of 100% confluent
- Vertelt wat over de groeifase van de cellen
Om hechtende cellen los te maken kunnen er 2 methodes gebruikt worden
- Schrapen (RAW-cellen)
- Trypsine (L929)
Je kunt cellen bijvoorbeeld 1:5 of 1:10 doorzetten. De berekeningen voor hechtende cellen
en suspensie cellen gaat wel iets anders:
- Hechtend = eerst cellen los maken door 1 mL trypsine toe te voegen en deze voor 20
seconde te
incuberen. daarna wordt 4 mL medium toegevoegd om het effect van trypsine op te heffen.
Nu is je
volume 5 mL
Wanneer we de oppervlakte dus 10x vergroten breng je dus 0,5 mL van dit mengsel over
in een
nieuwe fles waar al 9,5 mL nieuw medium zit
- Suspensie = de cellen zitten al in het medium, dus wanneer deze cellen worden doorgezet
kan van deze fles (10 mL volume) 1 mL gepakt worden en overgebracht worden in een
nieuwe flask, waar al 9 mL nieuw medium zit.
,Overige aandachtspunten:
- Vloeistoffen/medium worden eerst opgewarmd in een waterbad van 37 °C
- Spullen die je gebruikt wordt eerst gedesinfecteerd met 70% ethanol, je eigen handen
desinfecteer
je door ze eerst te wassen met zeep en daarna met sterilium
- Check of je alle spullen hebt voordat je begint met doorzetten. Anders moet je het pakken
en
opnieuw desinfecteren
- Controleer elke les je cellen onder de microscoop om te kijken naar de dichtbegroeiing en
of er
mogelijk contaminatie heeft plaatsgevonden
Cellen tellen
Cellen kunnen op 2 manieren geteld worden
- Telkamer (Fuchs Rosenthal/Burker Turk)
- Automatische celteller
Bij beide methodes wordt 1:1 verdund met Trypan Blue → dus even veel volume van beide
(sample en Trypan Blue), je verdunningsfactor is dan dus 2
- Vervolgens worden de kleurloze cellen geteld
- Blauwe cellen zijn de dode cellen
Formule om het aantal cellen/mL te berekenen met de telkamer
𝑁 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛
𝐶𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛/𝑚𝐿 = × 103 × 2
(16 × 0,25 × 0,25 × 0,2)
Voorbeeldberekening:
- In 16 vakjes worden 100 cellen geteld
- Deze Formule wordt gebruikt om het aantal cellen/mL te berekenen
𝑁 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛
𝐶𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛/𝑚𝐿 = × 103 × 2
(16 × 0,25 × 0,25 × 0,2)
− Deze kan vereenvoudigd worden op de volgende manier:
𝑁 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛
𝐶𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛/𝑚𝐿 = × 103 × 2
(0,2)
𝐶𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛/𝑚𝐿 = 𝑁 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛 × 104
Dus nu hoeven we alleen maar 100 cellen in te vullen bij N en dit te vermenigvuldigen met
104. In totaal zijn dat 1.106 cellen/mL
𝐶𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛/𝑚𝐿 = 𝑁 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛 × 104
𝐶𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛/𝑚𝐿 = 100 × 104
𝐶𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛/𝑚𝐿 = 1.000.000
Automatische cellenteller
- Slides die na gebruik weggegooid kunnen worden
- In de machine invoeren
- resultaten aflezen
,Les 2; Flow cytometrie DO11.10 cellen
Flow cytometrie = cel voor cel analyseren;
30.000/40.000 cellen/seconden
Doormiddel van lasers gericht op de cellen
- Meet licht verstrooiing (Forward en Side Scatter)
- Fluorescentie (meten op individuele celbasis)
1) Celsuspensie wordt opgenomen door een flowtip
2) Hydrodynamische focusing in de flowchamer (laat
de cellen een voor een door de laser)
Interrogation point = cellen gaan één voor één langs
de laser en worden geananlyseerd
FSC
- Licht wordt verstrooid en valt op een detector achter de laser (detector zit achter de
lichtstraal)
- Meet de grootte van de cel
- Afhankelijk van de celgrootte hoe ver het licht verstrooid wordt, en hoe groter de piek dus
wordt
SSC
- In een hoek van 90 graden aangestraald van de zijkant
- Meet de complexiteit van de cel (gesegmenteerde kern, veel granula of niet)
- Licht wordt verstrooid in alle kanten en wordt dus gemeten in een hoek van 90 graden.
Granula buigen deze lichtstralen, hoe meer deze aanwezig izjn hoe meer lichtbuigingen er
zullen zijn
Licht wordt verstrooid en valt op een detector achter de laser = FSC (Forward Scatter)
En het licht wordt naar de zijkanten verstrooid = SSC (Side Scatter)
, Dot-plot
Resultaten; FSC-SSC dot plots
- Density plots
- De kleuren geven de hoeveelheid aan
SSC (Side Scatter)
(populaties)
- Makkelijk cellen van elkaar
onderscheiden
- Granulocyten (heel complex, dus hoog
in de grafiek te vinden)
- Lymfocyten (klein en beetje complex)
- Monocyten (complex maar wat kleiner)
- Dode cellen (dood, dus weinig
compliciteit en kleinst, resten)
FSC (Forward Scatter)
Fluorescentie
- Fluorescentie = Bepaalde golflengte van licht
- Excitatie = emissie van elektronen
- Bij het aanstralen van fluorforen, zullen ze een bepaald fluorlicht uitstralen
- Er zijn verschillende fluorforen met verschillende excitatie/emissie golflengte (zorgen dat je
niet te
veel overlap hebt met deze verschillende golflengtes)
- Fluorforen koppelen aan specifieke antilichamen.
- Zijn er veel antilichamen aanwezig dan is er een hoge fluorescentie.
- T-cellen hebben een hoge waarde, want hier zijn veel antilichamen aanwezig
- De verschillende fluorforen worden gemeten door verschillende kanalen (verschillende
categorieën
(1 tm 4))
- Kanaal 1 = groen (530 nm)
- Kanaal 2 = oranje/geel (580 nm)
- Kanaal 3 en 4: rood (boven de 600 nm)
Longpastfilter: laat licht boven een bepaalde nm door
shortpasfilter: onder een bepaalde nm licht doorlaten
bandpassfilter: laat licht tussen verschillende nm door
Blauwe laser: FL 1 en FL 2 mee aanstralen (kanaal 1
en 2)
Excitatie 488 nm gericht op cellen
