moleculaire biologie: hoofdstuk 2 DNA-replicatie
1) inleiding
menselijke diploïde cel heeft 6,6 10 9 baseparen aan DNA
E. Coli heeft 4,5 106 baseparen aan DNA
3 theoretische hypothesen over DNA-replicatie:
▪ conservatieve replicatie: dubbele streng wordt integraal gekopieerd
▪ semi-conservatieve replicatie: 2 strengen uit elkaar gehaald en bij beide nieuwe streng
▪ dispersieve replicatie: deeltjes bijgemaakt en deeltjes bijgehouden
➔ experiment met E. Coli:
o gegroeid in medium met enkel N-15 (is zwaarder dus denser DNA)
o densiteitscentrifugatie en DNA in pellet en rest weggedaan
o nieuw medium met N-14 en laat E. Coli één keer repliceren
o maak er een homogenaat van en densiteitscentrifugatie
o resultaat: gemaakt DNA zit tussenin het DNA van N-14 en DNA van N-15
conservatief kan niet, andere 2 wel
o resultaat na 2x repliceren met N-14: 2 banden met één aan de N-14 band en één
aan de band tussenin
enkel semi-conservatieve kan
, moleculaire biologie: hoofdstuk 2 DNA-replicatie
2) DNA-replicatie
2.1 enzymen
DNA-polymerase heeft bepaalde kenmerken:
▪ hebben een voorbeeldstreng nodig
▪ hebben substraat nodig = deoxynucleotidetrifosfaten = dNTP’s
▪ 3’ OH-uiteinde nodig
polymerisatie:
1. bestaand 3’ OH-uiteinde, er komt een dNTP
2. α-fosfaat (op 5’-C) wordt verbonden aan 3’ OH
= 5’-3’ polymerisatie
3. β en γ fosfaat worden afgesplitst en die
energie gaat verloren dus onomkeerbare
reactie
proofreading = mechanisme tegen mogelijke fouten: C-G is perfecte B-helix en foute T-G is fout
→ T-G zit op de foute plaats en komt in contact met exonuclease (3’-5’) dat naast de polymerase
werkt, exonuclease knipt aan de buitenkant de fout eruit
één enzym met 2 actieve centra: één om af te breken en één om aan te maken
2.2 de replicatievork
= soort bel die ontstaat bij DNA-replicatie, waar eigenlijke replicatie gebeurt (links en rechts)
helicase nodig om helix uit elkaar te halen:
▪ helicase zit rond één van de 2 strengen = ringstructuur van 6x
zelfde eiwit
▪ door te schuiven moet het DNA wel uit elkaar gaan
▪ ATP voor gebruikt:
o 2 overliggende hebben ATP, 2 hebben ADP en
2 doen ATP eruit en zijn leeg
▪ helicasen wisselen hele tijd van vorm (door het
doorgeven van ATP) en kruipen zo over het DNA
1) inleiding
menselijke diploïde cel heeft 6,6 10 9 baseparen aan DNA
E. Coli heeft 4,5 106 baseparen aan DNA
3 theoretische hypothesen over DNA-replicatie:
▪ conservatieve replicatie: dubbele streng wordt integraal gekopieerd
▪ semi-conservatieve replicatie: 2 strengen uit elkaar gehaald en bij beide nieuwe streng
▪ dispersieve replicatie: deeltjes bijgemaakt en deeltjes bijgehouden
➔ experiment met E. Coli:
o gegroeid in medium met enkel N-15 (is zwaarder dus denser DNA)
o densiteitscentrifugatie en DNA in pellet en rest weggedaan
o nieuw medium met N-14 en laat E. Coli één keer repliceren
o maak er een homogenaat van en densiteitscentrifugatie
o resultaat: gemaakt DNA zit tussenin het DNA van N-14 en DNA van N-15
conservatief kan niet, andere 2 wel
o resultaat na 2x repliceren met N-14: 2 banden met één aan de N-14 band en één
aan de band tussenin
enkel semi-conservatieve kan
, moleculaire biologie: hoofdstuk 2 DNA-replicatie
2) DNA-replicatie
2.1 enzymen
DNA-polymerase heeft bepaalde kenmerken:
▪ hebben een voorbeeldstreng nodig
▪ hebben substraat nodig = deoxynucleotidetrifosfaten = dNTP’s
▪ 3’ OH-uiteinde nodig
polymerisatie:
1. bestaand 3’ OH-uiteinde, er komt een dNTP
2. α-fosfaat (op 5’-C) wordt verbonden aan 3’ OH
= 5’-3’ polymerisatie
3. β en γ fosfaat worden afgesplitst en die
energie gaat verloren dus onomkeerbare
reactie
proofreading = mechanisme tegen mogelijke fouten: C-G is perfecte B-helix en foute T-G is fout
→ T-G zit op de foute plaats en komt in contact met exonuclease (3’-5’) dat naast de polymerase
werkt, exonuclease knipt aan de buitenkant de fout eruit
één enzym met 2 actieve centra: één om af te breken en één om aan te maken
2.2 de replicatievork
= soort bel die ontstaat bij DNA-replicatie, waar eigenlijke replicatie gebeurt (links en rechts)
helicase nodig om helix uit elkaar te halen:
▪ helicase zit rond één van de 2 strengen = ringstructuur van 6x
zelfde eiwit
▪ door te schuiven moet het DNA wel uit elkaar gaan
▪ ATP voor gebruikt:
o 2 overliggende hebben ATP, 2 hebben ADP en
2 doen ATP eruit en zijn leeg
▪ helicasen wisselen hele tijd van vorm (door het
doorgeven van ATP) en kruipen zo over het DNA
