vragen histologie 2022-2023
1 Vgl conventionele lichtmicroscopie met transmissie e-microscopie (TEM).
Wat kan je met beide technieken onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken weefsel
voorbewerkt worden voor deze methoden en waarom?
Conventionele lichtmicroscoop Transmissie E-microscopie
- bundel op staal insturen om 2D beeld te krijgen
- beide zijn methodes om cel/organisme te bekijken
- bron: zichtbaar licht - bron: bundel e-
(λ = 300-750nm) -> lagere resolutie (λ = 10-12m) -> hogere resolutie
Stereomicro: licht dat op object zelf valt weerkaatst w - 2 soorten:
‘gwne’: doorvallend licht TEM: transmissie e-nenmicroscopie
- gebruik van verwisselbare oculairen/lenzen SEM: scanning/surface e- microscopie
en objectieven -> raster
- resolutie: ± 0.2 μm (micrometer) - resolutie: 0.1 nm (nanometer)
- waarneming ultrastruct v cellen
- fotonen w door preparaat heen geschoten + - e-nen w door preparaat heen geschoten +
Opgevangen op gevoelige plaat opgevangen op gevoelige plaat
- beeld in kleur - beeld in zwart-wit
- weefselpreparatie: (zie nr2) - weefselpreparatie:
1) bewaring (fixeren) 1) gefixeerde weefsels (met glutaaraldehyde)
• Invriezen Ingebed in epoxyhars (ipv parafinne)
- snel in OCT-opl 2) dunne coupes v 1 μm
- verdere bewaring op -80°C -> gesneden met diamant/glasmes
• Fixeren 3) 2e fixatie: fixatie v glutaraldehyde (OsO4)
- onderdompeling in fixatieVL Kleurt het weefsel
- inbedding in parafinne mbv dehydratatie
2) weefselsneden (microtoom)
3) kleuring
- visualisatie voor levende cellen & molec - visualisatie intracellulaire struct
(virussen, DNA…)
, 2. Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaraldehyde bij de
staalpreparatie voor histologie.
Voor welke histologische methoden worden deze gebruikt?
Fixatie mbv formaldehyde
-> meest gebruikte fixator: formol = waterige opl op basis v formaldehyde
1) Weefsel w ondergedompeld in fixatie-VL:
-> duur: 2-24h,
afh v: - grootte materiaal vh te fixeren materiaal
- gebruikte meth v fixatie en fixator
-> hoeveelh fixator: min 5x V van weefsel
-F-> zorgt ervoor dat functie bewaard blijft
-G-> - crosslinking: vorming covalente bd tssn N-terminale groepen v eiwitten
-> zo vasthechting prot aan cytoskelet & interagerende prot (functie bewaring)
- enzymen verliezen enzymatische werking
2) weefsel inbedden in paraffine om het te ku snijden mbv dehydratatie
= onttrekking H2O uit weefsel mbv alcoholopl
-R-> fixatieven zijn water-gebaseerd -> niet mengbaar met hydrofoob paraffine
Fixatie mbv glutaraldehyde
+- = werkwijze als fixatie met formaldehyde
Functie glutaraldehyde: polymeervorming (ipv crosslinking bij formalaldehyde)
W gebruikt voor staalpreparatie voor e-microscoop
2
,3
, 3. Geef gelijkenissen en verschillen tssn immunohistochemie en immunofluorescentie.
Immunohistochemie Immunofluorescentie
Meth om aanwezigheid prot kwalitatief te bepalen
Gebruik van specifieke antistoffen
In vitro omstandigheden
• Antistof met fluorescente eig dat zal bd op prot • Secundair gelabeld antilichaam zal bd op prim.
-G-> vrijgave fluorescent sign: prot zichtbaar Antilich. -G-> chemische reactie
• Gebruik v meerdere antistoffen tegelijk • Gevoeliger:
Mogelijk Prim. Antilichaam heeft meerde bdsplaatsen voor
sec antilich.
• Minder specifieke reactie • Specifiekere reactie:
Minder antilichaam vermindert risico op minder
Specifieke kruisreacties
4
1 Vgl conventionele lichtmicroscopie met transmissie e-microscopie (TEM).
Wat kan je met beide technieken onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken weefsel
voorbewerkt worden voor deze methoden en waarom?
Conventionele lichtmicroscoop Transmissie E-microscopie
- bundel op staal insturen om 2D beeld te krijgen
- beide zijn methodes om cel/organisme te bekijken
- bron: zichtbaar licht - bron: bundel e-
(λ = 300-750nm) -> lagere resolutie (λ = 10-12m) -> hogere resolutie
Stereomicro: licht dat op object zelf valt weerkaatst w - 2 soorten:
‘gwne’: doorvallend licht TEM: transmissie e-nenmicroscopie
- gebruik van verwisselbare oculairen/lenzen SEM: scanning/surface e- microscopie
en objectieven -> raster
- resolutie: ± 0.2 μm (micrometer) - resolutie: 0.1 nm (nanometer)
- waarneming ultrastruct v cellen
- fotonen w door preparaat heen geschoten + - e-nen w door preparaat heen geschoten +
Opgevangen op gevoelige plaat opgevangen op gevoelige plaat
- beeld in kleur - beeld in zwart-wit
- weefselpreparatie: (zie nr2) - weefselpreparatie:
1) bewaring (fixeren) 1) gefixeerde weefsels (met glutaaraldehyde)
• Invriezen Ingebed in epoxyhars (ipv parafinne)
- snel in OCT-opl 2) dunne coupes v 1 μm
- verdere bewaring op -80°C -> gesneden met diamant/glasmes
• Fixeren 3) 2e fixatie: fixatie v glutaraldehyde (OsO4)
- onderdompeling in fixatieVL Kleurt het weefsel
- inbedding in parafinne mbv dehydratatie
2) weefselsneden (microtoom)
3) kleuring
- visualisatie voor levende cellen & molec - visualisatie intracellulaire struct
(virussen, DNA…)
, 2. Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaraldehyde bij de
staalpreparatie voor histologie.
Voor welke histologische methoden worden deze gebruikt?
Fixatie mbv formaldehyde
-> meest gebruikte fixator: formol = waterige opl op basis v formaldehyde
1) Weefsel w ondergedompeld in fixatie-VL:
-> duur: 2-24h,
afh v: - grootte materiaal vh te fixeren materiaal
- gebruikte meth v fixatie en fixator
-> hoeveelh fixator: min 5x V van weefsel
-F-> zorgt ervoor dat functie bewaard blijft
-G-> - crosslinking: vorming covalente bd tssn N-terminale groepen v eiwitten
-> zo vasthechting prot aan cytoskelet & interagerende prot (functie bewaring)
- enzymen verliezen enzymatische werking
2) weefsel inbedden in paraffine om het te ku snijden mbv dehydratatie
= onttrekking H2O uit weefsel mbv alcoholopl
-R-> fixatieven zijn water-gebaseerd -> niet mengbaar met hydrofoob paraffine
Fixatie mbv glutaraldehyde
+- = werkwijze als fixatie met formaldehyde
Functie glutaraldehyde: polymeervorming (ipv crosslinking bij formalaldehyde)
W gebruikt voor staalpreparatie voor e-microscoop
2
,3
, 3. Geef gelijkenissen en verschillen tssn immunohistochemie en immunofluorescentie.
Immunohistochemie Immunofluorescentie
Meth om aanwezigheid prot kwalitatief te bepalen
Gebruik van specifieke antistoffen
In vitro omstandigheden
• Antistof met fluorescente eig dat zal bd op prot • Secundair gelabeld antilichaam zal bd op prim.
-G-> vrijgave fluorescent sign: prot zichtbaar Antilich. -G-> chemische reactie
• Gebruik v meerdere antistoffen tegelijk • Gevoeliger:
Mogelijk Prim. Antilichaam heeft meerde bdsplaatsen voor
sec antilich.
• Minder specifieke reactie • Specifiekere reactie:
Minder antilichaam vermindert risico op minder
Specifieke kruisreacties
4
