1. Het Concept van Proefdierbeeldvorming
Het doel is om biologische processen niet-invasief in levende dieren (meestal muizen/ratten) te
visualiseren.
• Voordelen:
o Seriële opvolging: Je kunt hetzelfde dier over langere tijd volgen (longitudinaal
onderzoek).
o Minder dieren nodig: Omdat dieren hun eigen controle zijn, heb je minder
biologische variatie en meer statistische power (gepaarde testen) .
o Selectie: Je kunt dieren selecteren op basis van succesvolle ziekte-inductie (bv.
infarctgrootte) voordat je de therapie start .
2. Reportergenen
BLI is gebaseerd op het principe van reportergenen. Je moet de definitie en eigenschappen goed
kennen.
• Definitie: Een gen dat codeert voor een eiwit dat eenvoudig meetbaar/detecteerbaar is (in
dit geval via lichtproductie).
• Het Centrale Dogma: DNA (Reporter Gen) à mRNA à Eiwit (Enzym) à Detectie via
beeldvorming .
• Eigenschappen van het ideale reportergen:
o Niet-immunogeen (wordt niet afgestoten) en klein genoeg
o Niet-toxisch voor de cel.
o Geen biologisch effect op de celprocessen.
o Signaal moet correleren met de hoeveelheid mRNA/eiwit .
• Eigenschappen van de ideale "Probe" (het substraat):
o Hoopt alleen op waar het gen tot expressie komt & kan doelwit bereiken
o Stabiel in vivo, snelle klaring uit bloed, penetreert barrières .
3. Fysico-biologisch werkingsmechanisme van BLI
Dit is de kern van hoe het signaal ontstaat.
• De Chemische Reactie: Bioluminescentie is lichtproductie door een chemische reactie in
een levend organisme.
o Algemene reactie:
Luciferine(substraat) + Luciferase(enzym) + O2 +ATP + Mg2+ → Oxyluciferine + Licht
o Belangrijk: Bij Firefly luciferase is ATP nodig. Dit betekent dat je alleen signaal krijgt
uit metabolisch actieve (levende) cellen.
• Verschillende systemen (Substraatspecificiteit):
o Firefly Luciferase (Fluc): Komt van de vuurvlieg. Substraat is D-
Luciferine. Piekemissie rond 560 nm (geel-groen).
o Renilla/Gaussia: Mariene oorsprong (kwallen/koralen). Substraat
is Coelenterazine. Deze zijn vaak ATP-onafhankelijk.
o Let op: De substraten passen niet in elkaars enzymen (slot-sleutel principe).
4. Fysica en Beperkingen (Lichttransport)
Licht verplaatst zich moeilijk door weefsel. Dit moet je goed kunnen uitleggen.
, • Absorptie: Hemoglobine en water absorberen veel zichtbaar licht. Vooral blauw en groen
licht worden sterk geabsorbeerd. Rood licht gaat er beter doorheen .
• De "Near Infrared (NIR) Window": Het gebied (ong. 650-900 nm) waar absorptie door
weefsel minimaal is. Licht in dit spectrum dringt het diepst door.
• Gevolgen voor het beeld (in vivo):
o Red-shift: Het spectrum van licht dat uit het dier komt is "roder" dan het licht in een
proefbuisje, omdat de blauwe/groene componenten zijn weggefilterd door het
weefsel .
o Scatter (Verstrooiing): Licht botst tegen cellen en verandert van richting. Hierdoor
verlies je spatiële resolutie (je ziet een "vlek" i.p.v. scherpe punt) en kwantitatieve
nauwkeurigheid bij diepere organen .
o Signaalverlies: Signaal neemt af met een factor 10 per cm weefseldiepte. Daarom
werkt BLI vooral goed bij kleine dieren (muizen).
5. Apparatuur en Data-analyse
• IVIS Systeem:
o Gebruikt een gekoelde CCD camera (om thermische ruis te verminderen).
o Staat in een volledig lichtdichte doos ("black box") omdat het signaal erg zwak is.
• Procedure: Injectie substraat (IP of IV) wachten op verdeling meting (van seconden tot
minuten) .
• Het beeld:
o Je krijgt een "pseudocolor" beeld over een zwart-wit foto van de muis.
o Rood = hoge intensiteit, Blauw = lage intensiteit (dit is niet de kleur van het licht,
maar de hoeveelheid fotonen!) .
• Kwantificatie (Eenheid): De eenheid van het signaal
is Photons/second/cm²/steradian. Er is een lineaire correlatie tussen het aantal cellen en
de gemeten flux.
• Hoe langer je meet, hoe meer signaal + hoe groter de hoek, hoe meer fotonen capteren +
hoe verder dier van detector, onder hoe kleinere hoek gemeten wordt
6. Toepassingen van BLI
Je moet weten waarvoor dit gebruikt wordt en voorbeelden kunnen geven.
1. Gentherapie:
o Controleren of je vector (bv. virus) succesvol is aangekomen in het doelorgaan (bv.
striatum in hersenen).
o Gebruik van bicistronische vectoren (bv. met IRES): Het therapeutisch gen en het
reportergen (luciferase) worden samen afgelezen. Licht = aanwezigheid van
therapie .
2. Celtherapie (Stamcellen):
o Cellen in vitro labelen met luciferase en dan injecteren.
o Je kunt zien of cellen overleven (signaal blijft) of sterven (signaal verdwijnt) en of ze
migreren naar een laesie of tumor.
3. Oncologie (Kankeronderzoek):
o Gevoeliger dan meten met een schuifmaat. Je kunt metastasen (uitzaaiingen) zien
voordat ze zichtbaar zijn met het blote oog.
o Monitoring van tumorrespons op chemotherapie (signaalstagnatie of afname).
4. Infectieziekten:
o Virussen of bacteriën labelen met luciferase.
o Effectiviteit van antibiotica of antivirale middelen testen (signaal moet dalen).
5. Eiwit-Eiwit Interacties (Split Reporter):
o Het luciferase enzym wordt in tweeën gesplitst (N-deel en C-deel). Beide delen zijn
inactief.
Het doel is om biologische processen niet-invasief in levende dieren (meestal muizen/ratten) te
visualiseren.
• Voordelen:
o Seriële opvolging: Je kunt hetzelfde dier over langere tijd volgen (longitudinaal
onderzoek).
o Minder dieren nodig: Omdat dieren hun eigen controle zijn, heb je minder
biologische variatie en meer statistische power (gepaarde testen) .
o Selectie: Je kunt dieren selecteren op basis van succesvolle ziekte-inductie (bv.
infarctgrootte) voordat je de therapie start .
2. Reportergenen
BLI is gebaseerd op het principe van reportergenen. Je moet de definitie en eigenschappen goed
kennen.
• Definitie: Een gen dat codeert voor een eiwit dat eenvoudig meetbaar/detecteerbaar is (in
dit geval via lichtproductie).
• Het Centrale Dogma: DNA (Reporter Gen) à mRNA à Eiwit (Enzym) à Detectie via
beeldvorming .
• Eigenschappen van het ideale reportergen:
o Niet-immunogeen (wordt niet afgestoten) en klein genoeg
o Niet-toxisch voor de cel.
o Geen biologisch effect op de celprocessen.
o Signaal moet correleren met de hoeveelheid mRNA/eiwit .
• Eigenschappen van de ideale "Probe" (het substraat):
o Hoopt alleen op waar het gen tot expressie komt & kan doelwit bereiken
o Stabiel in vivo, snelle klaring uit bloed, penetreert barrières .
3. Fysico-biologisch werkingsmechanisme van BLI
Dit is de kern van hoe het signaal ontstaat.
• De Chemische Reactie: Bioluminescentie is lichtproductie door een chemische reactie in
een levend organisme.
o Algemene reactie:
Luciferine(substraat) + Luciferase(enzym) + O2 +ATP + Mg2+ → Oxyluciferine + Licht
o Belangrijk: Bij Firefly luciferase is ATP nodig. Dit betekent dat je alleen signaal krijgt
uit metabolisch actieve (levende) cellen.
• Verschillende systemen (Substraatspecificiteit):
o Firefly Luciferase (Fluc): Komt van de vuurvlieg. Substraat is D-
Luciferine. Piekemissie rond 560 nm (geel-groen).
o Renilla/Gaussia: Mariene oorsprong (kwallen/koralen). Substraat
is Coelenterazine. Deze zijn vaak ATP-onafhankelijk.
o Let op: De substraten passen niet in elkaars enzymen (slot-sleutel principe).
4. Fysica en Beperkingen (Lichttransport)
Licht verplaatst zich moeilijk door weefsel. Dit moet je goed kunnen uitleggen.
, • Absorptie: Hemoglobine en water absorberen veel zichtbaar licht. Vooral blauw en groen
licht worden sterk geabsorbeerd. Rood licht gaat er beter doorheen .
• De "Near Infrared (NIR) Window": Het gebied (ong. 650-900 nm) waar absorptie door
weefsel minimaal is. Licht in dit spectrum dringt het diepst door.
• Gevolgen voor het beeld (in vivo):
o Red-shift: Het spectrum van licht dat uit het dier komt is "roder" dan het licht in een
proefbuisje, omdat de blauwe/groene componenten zijn weggefilterd door het
weefsel .
o Scatter (Verstrooiing): Licht botst tegen cellen en verandert van richting. Hierdoor
verlies je spatiële resolutie (je ziet een "vlek" i.p.v. scherpe punt) en kwantitatieve
nauwkeurigheid bij diepere organen .
o Signaalverlies: Signaal neemt af met een factor 10 per cm weefseldiepte. Daarom
werkt BLI vooral goed bij kleine dieren (muizen).
5. Apparatuur en Data-analyse
• IVIS Systeem:
o Gebruikt een gekoelde CCD camera (om thermische ruis te verminderen).
o Staat in een volledig lichtdichte doos ("black box") omdat het signaal erg zwak is.
• Procedure: Injectie substraat (IP of IV) wachten op verdeling meting (van seconden tot
minuten) .
• Het beeld:
o Je krijgt een "pseudocolor" beeld over een zwart-wit foto van de muis.
o Rood = hoge intensiteit, Blauw = lage intensiteit (dit is niet de kleur van het licht,
maar de hoeveelheid fotonen!) .
• Kwantificatie (Eenheid): De eenheid van het signaal
is Photons/second/cm²/steradian. Er is een lineaire correlatie tussen het aantal cellen en
de gemeten flux.
• Hoe langer je meet, hoe meer signaal + hoe groter de hoek, hoe meer fotonen capteren +
hoe verder dier van detector, onder hoe kleinere hoek gemeten wordt
6. Toepassingen van BLI
Je moet weten waarvoor dit gebruikt wordt en voorbeelden kunnen geven.
1. Gentherapie:
o Controleren of je vector (bv. virus) succesvol is aangekomen in het doelorgaan (bv.
striatum in hersenen).
o Gebruik van bicistronische vectoren (bv. met IRES): Het therapeutisch gen en het
reportergen (luciferase) worden samen afgelezen. Licht = aanwezigheid van
therapie .
2. Celtherapie (Stamcellen):
o Cellen in vitro labelen met luciferase en dan injecteren.
o Je kunt zien of cellen overleven (signaal blijft) of sterven (signaal verdwijnt) en of ze
migreren naar een laesie of tumor.
3. Oncologie (Kankeronderzoek):
o Gevoeliger dan meten met een schuifmaat. Je kunt metastasen (uitzaaiingen) zien
voordat ze zichtbaar zijn met het blote oog.
o Monitoring van tumorrespons op chemotherapie (signaalstagnatie of afname).
4. Infectieziekten:
o Virussen of bacteriën labelen met luciferase.
o Effectiviteit van antibiotica of antivirale middelen testen (signaal moet dalen).
5. Eiwit-Eiwit Interacties (Split Reporter):
o Het luciferase enzym wordt in tweeën gesplitst (N-deel en C-deel). Beide delen zijn
inactief.
