H3: hoge prestatie
vloeistofchromatografie (HPLC)
Inleiding
In de jaren 70 bleek klassieke vloeistofkolomchromatografie (LSC en
LLC) weinig efficiënt vergeleken met gaschromatografie
o Lange elutietijden onder hydrostatische druk leiden tot diffusie
en vervaging van zones
Kleinere korreldiameter van de stationaire fase verbetert scheiding,
maar verlengt analysetijd bij dezelfde kolomlengte en druk
o Rond 1970 kon de korrelgrootte worden verkleind van 150 µm
naar 10 µm, wat snelle analyses mogelijk maakt mits hogere
ingangsdruk van de mobiele fase
o Dit leidde tot HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
met drukken van 50–300 bar
HPLC is snel groeiend, heeft een belangrijke plaats naast
gaschromatografie, en wordt gebruikt voor research en
routineanalyses
o Sinds 2004 bestaat UPLC (Ultra High Performance Liquid
Chromatography) met kolldetails van 1,8 µm en drukken
>1000 bar.
Redenen voor HPLC’s populariteit:
o Scheidingen die vroeger uren duurden, nu in minuten mogelijk
o Zeer gevoelig methode
o Geschikt voor accurate kwantitatieve bepalingen
o Veel goede detectoren beschikbaar
o Kan niet-vluchtige en thermolabiele stoffen scheiden en
kwantificeren
Voorbeelden van stoffen die HPLC kan analyseren: aminozuren,
proteïnen, nucleïnezuren, hormonen, suikers, steroïden, drugs,
pesticiden, antibiotica…
Apparatuur
Pomp:
, Voor snelle en efficiënte HPLC-scheidingen moet de pomp:
o Een regelbare en constante stroming van de mobiele fase
leveren
o Pulsvrij werken om storing van detectoren (bv. UV-detector) te
vermijden
Drukpulsen veroorzaken een zigzag in de basislijn, waardoor kleine
signalen moeilijk meetbaar zijn en de gevoeligheid afneemt.
Alternatieve plunjerpomp:
o Zuiger beweegt voor- en achterwaarts in een kleine kamer
o Klepsysteem zorgt voor beurtelings opzuigen en naar kolom
sturen van vloeistof
Probleem: een enkele kamer levert pulsen → oplossing: dubbele
kamer, zodat de ene kamer vult terwijl de andere pompt
Opmerking: bij hoge druk kan gas oplossen in de vloeistof →
ontgassen van oplosmiddelen is noodzakelijk om problemen in de
detector te voorkomen
Het injectiesysteem
Het injectiesysteem zorgt ervoor dat een opgeloste monster in de
vloeistofstroom wordt gebracht zonder de stroom te onderbreken en
zonder verdunning van het staal, zodat de reproduceerbaarheid,
gevoeligheid en scheidingskwaliteit behouden blijven
(a) Septuminjector
Eenvoudigste type injector
Injectie met een spuit via een rubberen septum direct boven de
kolomvulling
De vloeistofstroom blijft lopen
Alleen bruikbaar bij lage druk
(b) Stop-flow injector
Vergelijkbaar met de septuminjector, maar de vloeistofstroom wordt
tijdelijk gestopt tijdens de injectie
De injectiepoort wordt geopend, het staal ingebracht, daarna
gesloten en de stroom hersteld
Geschikt voor hogere drukken
(c) Lus- of loopinjector
Een buisje met vast volume (lus) wordt eerst gevuld met het staal
Vervolgens wordt de solventstroom omgeschakeld zodat het staal
naar de kolom wordt gevoerd
Het geïnjecteerde volume hangt af van de lengte en diameter van
de lus
Voor een ander volume moet de lus worden vervangen
Geeft iets meer piekverbreding, maar biedt hoge
reproduceerbaarheid
, Isocratische elutie vs gradiëntelutie
Isocratische elutie
De loopfase (mobiele fase) blijft de hele analyse hetzelfde
Geschikt voor eenvoudige mengsels met vergelijkbare componenten
Eenvoudig systeem, maar minder efficiënt bij componenten met
sterk verschillende polariteit.
Gradiëntelutie
De samenstelling van de loopfase verandert tijdens de analyse
Wordt gebruikt voor complexe mengsels met grote verschillen in
polariteit
Door de oplosmiddelsterkte geleidelijk te verhogen, elueren sterk
gebonden componenten sneller → betere scheiding in kortere tijd
Twee uitvoeringen:
o Hoge-drukgradiëntsysteem: meerdere solventen, meerdere
pompen en een mengkamer op hoge druk
o Lage-drukgradiëntsysteem: meerdere solventen, een
proportioneringsklep en één pomp
Kolommen en kolomvullingen (algemeen)
Kolommen
In vloeistofchromatografie worden altijd gepakte kolommen gebruikt
Glazen kolommen zijn ongeschikt bij hoge drukken → roestvrijstalen
kolommen geven de beste resultaten (gladde binnenwand,
constante diameter).
Diameter: in analytische HPLC meestal 3–5 mm.
Vorm: meestal recht, voor eenvoudig vullen.
Kolomvullingen (stationaire fase)
Bestaat uit korrelmateriaal met hoge porositeit → groot specifiek
oppervlak
Vroegere pakkingen:
o Grote deeltjes (> 40 µm), zeer poreus
o Voordeel: groot staalvolume
o Nadeel: grote verschillen in diffusietijden (in en uit poriën) →
minder efficiënt en piekverbreding
Verbeteringen
1. Porous Layer Beads (PLB)
o Glaspartikels met dunne poreuze laag stationaire fase.
o Voordelen: hogere efficiëntie, hogere lineaire snelheden
mogelijk.
o Nadelen: duur en lage capaciteit (klein specifiek oppervlak
t.o.v. diameter).
2. Micropartikels (5–10 µm, sinds 1970)
vloeistofchromatografie (HPLC)
Inleiding
In de jaren 70 bleek klassieke vloeistofkolomchromatografie (LSC en
LLC) weinig efficiënt vergeleken met gaschromatografie
o Lange elutietijden onder hydrostatische druk leiden tot diffusie
en vervaging van zones
Kleinere korreldiameter van de stationaire fase verbetert scheiding,
maar verlengt analysetijd bij dezelfde kolomlengte en druk
o Rond 1970 kon de korrelgrootte worden verkleind van 150 µm
naar 10 µm, wat snelle analyses mogelijk maakt mits hogere
ingangsdruk van de mobiele fase
o Dit leidde tot HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
met drukken van 50–300 bar
HPLC is snel groeiend, heeft een belangrijke plaats naast
gaschromatografie, en wordt gebruikt voor research en
routineanalyses
o Sinds 2004 bestaat UPLC (Ultra High Performance Liquid
Chromatography) met kolldetails van 1,8 µm en drukken
>1000 bar.
Redenen voor HPLC’s populariteit:
o Scheidingen die vroeger uren duurden, nu in minuten mogelijk
o Zeer gevoelig methode
o Geschikt voor accurate kwantitatieve bepalingen
o Veel goede detectoren beschikbaar
o Kan niet-vluchtige en thermolabiele stoffen scheiden en
kwantificeren
Voorbeelden van stoffen die HPLC kan analyseren: aminozuren,
proteïnen, nucleïnezuren, hormonen, suikers, steroïden, drugs,
pesticiden, antibiotica…
Apparatuur
Pomp:
, Voor snelle en efficiënte HPLC-scheidingen moet de pomp:
o Een regelbare en constante stroming van de mobiele fase
leveren
o Pulsvrij werken om storing van detectoren (bv. UV-detector) te
vermijden
Drukpulsen veroorzaken een zigzag in de basislijn, waardoor kleine
signalen moeilijk meetbaar zijn en de gevoeligheid afneemt.
Alternatieve plunjerpomp:
o Zuiger beweegt voor- en achterwaarts in een kleine kamer
o Klepsysteem zorgt voor beurtelings opzuigen en naar kolom
sturen van vloeistof
Probleem: een enkele kamer levert pulsen → oplossing: dubbele
kamer, zodat de ene kamer vult terwijl de andere pompt
Opmerking: bij hoge druk kan gas oplossen in de vloeistof →
ontgassen van oplosmiddelen is noodzakelijk om problemen in de
detector te voorkomen
Het injectiesysteem
Het injectiesysteem zorgt ervoor dat een opgeloste monster in de
vloeistofstroom wordt gebracht zonder de stroom te onderbreken en
zonder verdunning van het staal, zodat de reproduceerbaarheid,
gevoeligheid en scheidingskwaliteit behouden blijven
(a) Septuminjector
Eenvoudigste type injector
Injectie met een spuit via een rubberen septum direct boven de
kolomvulling
De vloeistofstroom blijft lopen
Alleen bruikbaar bij lage druk
(b) Stop-flow injector
Vergelijkbaar met de septuminjector, maar de vloeistofstroom wordt
tijdelijk gestopt tijdens de injectie
De injectiepoort wordt geopend, het staal ingebracht, daarna
gesloten en de stroom hersteld
Geschikt voor hogere drukken
(c) Lus- of loopinjector
Een buisje met vast volume (lus) wordt eerst gevuld met het staal
Vervolgens wordt de solventstroom omgeschakeld zodat het staal
naar de kolom wordt gevoerd
Het geïnjecteerde volume hangt af van de lengte en diameter van
de lus
Voor een ander volume moet de lus worden vervangen
Geeft iets meer piekverbreding, maar biedt hoge
reproduceerbaarheid
, Isocratische elutie vs gradiëntelutie
Isocratische elutie
De loopfase (mobiele fase) blijft de hele analyse hetzelfde
Geschikt voor eenvoudige mengsels met vergelijkbare componenten
Eenvoudig systeem, maar minder efficiënt bij componenten met
sterk verschillende polariteit.
Gradiëntelutie
De samenstelling van de loopfase verandert tijdens de analyse
Wordt gebruikt voor complexe mengsels met grote verschillen in
polariteit
Door de oplosmiddelsterkte geleidelijk te verhogen, elueren sterk
gebonden componenten sneller → betere scheiding in kortere tijd
Twee uitvoeringen:
o Hoge-drukgradiëntsysteem: meerdere solventen, meerdere
pompen en een mengkamer op hoge druk
o Lage-drukgradiëntsysteem: meerdere solventen, een
proportioneringsklep en één pomp
Kolommen en kolomvullingen (algemeen)
Kolommen
In vloeistofchromatografie worden altijd gepakte kolommen gebruikt
Glazen kolommen zijn ongeschikt bij hoge drukken → roestvrijstalen
kolommen geven de beste resultaten (gladde binnenwand,
constante diameter).
Diameter: in analytische HPLC meestal 3–5 mm.
Vorm: meestal recht, voor eenvoudig vullen.
Kolomvullingen (stationaire fase)
Bestaat uit korrelmateriaal met hoge porositeit → groot specifiek
oppervlak
Vroegere pakkingen:
o Grote deeltjes (> 40 µm), zeer poreus
o Voordeel: groot staalvolume
o Nadeel: grote verschillen in diffusietijden (in en uit poriën) →
minder efficiënt en piekverbreding
Verbeteringen
1. Porous Layer Beads (PLB)
o Glaspartikels met dunne poreuze laag stationaire fase.
o Voordelen: hogere efficiëntie, hogere lineaire snelheden
mogelijk.
o Nadelen: duur en lage capaciteit (klein specifiek oppervlak
t.o.v. diameter).
2. Micropartikels (5–10 µm, sinds 1970)
