Samenvatting Moleculaire
Diagnostiek
H0: Situering van de moleculaire diagnostiek
0.1 Wat zijn moleculaire testen?
= Gespecialiseerde technieken die in het moleculairbiologisch labo worden gebruikt om rechtstreeks het erfelijk
materiaal (DNA / RNA) van menselijke cellen of micro-organismen te onderzoeken.
DNA-hybridisatie:
- Doelwit-DNA wordt gekoppeld met een DNA-probe
Probe evt. gekoppeld met fluorescerende molecule (visualisatie bij FISH)
- Niet zo gevoelig als DNA-amplificatie
DNA-amplificatie:
- Een deeltje van het DNA wordt exponentieel gekopieerd
- PCR en real-time PCR
- Enorm gevoelig
Dus ook vatbaar voor contaminatie
Sequencing:
- De exacte sequentie van een bepaald gen achterhalen om erfelijke ziektes of aandoeningen op te sporen
die veroorzaakt worden door mutaties in het genetische materiaal
- Kankers en mutaties opsporen
IVD-kits:
- In vitro diagnostics
- Commerciële testen / CE-marketing
RUO:
- Research only
- Commerciële kits
- Enkel aangeraden op dat moment voor het gebruik in het onderzoek
Home-brew: thuistesten
Volautomaten: robots, …
Voordelen van moleculaire testen:
- Hoge gevoeligheid
= percentage aan positieven in de groep van zieke mensen
Lage hoeveelheid materiaal nodig voor de detectie
- Specificiteit
= percentage van negatieven in de groep van de niet zieke mensen
- Snelle rapportering
Nadelen van moleculaire testen:
- PCR: contaminatie gevoelig
Kwaliteitscontrole is belangrijk
,0.2 Domeinen in de moleculaire diagnostiek
Erfelijke genetische afwijkingen:
Afwijkingen in het menselijk genetische materiaal die erfelijk zijn
Constitutioneel genetische afwijkingen
Centrum voor menselijke erfelijkheid (4 in Vlaanderen)
- Onderzoekt erfelijk karakter van aandoeningen
- Ontwikkelt technieken om erfelijke ziekten en / of handicaps te voorkomen
Verworven genetische afwijkingen:
Afwijkingen in het menselijke genetische materiaal die verworven zijn
Verworven genetische afwijkingen
Centrum voor moleculaire diagnostiek
- Verbonden aan het ziekenhuis
- Onderzoek naar mutaties verantwoordelijk voor het ontstaan van kanker
Infectieziekten:
Genetische materiaal van micro-organismen zoals bacteriën of virussen
Microbiologie, virologie of parasitologie
- Diagnose stellen
- Therapie van een infectie opvolgen
Gerechtelijke geneeskunde:
Variaties in het menselijke genetische materiaal van verschillende individuen
Forensisch onderzoek
- Variaties in genetische materiaal om bepaalde erfelijke aandoeningen te voorspellen
- Identificatie
, H1: Kwantitatieve PCR (qPCR)
1.1 qPCR en conventionele PCR
Conventionele PCR:
- Detectie tijdens de plateau fase
- Niet kwantitatief
qPCR / real time PCR:
- Detectie in real time
Elke cyclus hoeveelheid PCR product meten
- Kwantitatief
- PCR-producten gekoppeld aan fluorescerende stof of
probe
- # fluorescentie ~ # gevormde PCR product
Voordelen qPCR:
- PCR-product moet na afloop van de reactie niet meer geanalyseerd worden
Geen contaminatie
- Kwantificering van het startmateriaal is mogelijk
- Meerdere kleuren fluorescentie kunnen gedetecteerd worden
Multiplex
a)
1: Target denatureren
2: Annealingsfase: primers binden
3: Extensie-fase:
- PCR-product wordt gemaakt
- Ontstaan fluorescentiesignaal door binding
fluorescerende DNA-bindende kleurstoffen /
door
afbraak van de hydrolisatie-probe
b) Elke cyclus zal er meer PCR-product dus ook meer
fluorescentie aanwezig zijn.
c) Toename fluorescentie.
1e cycli: nauwelijks PCR-product, nauwelijks
fluorescentie
na aantal cycli: # PCR-product stijgt, fluorescentie stijgt
na 20-40 cycli: reactiecomponenten raken uitgeput,
nauwelijks toename van PCR-product, nauwelijks fluorescentie
= plateaufase
1.2 Fluorescentie
qPCR Fluorescentie
Fluorochromen = moleculen die energie in de vorm van licht kunnen opnemen
- Grondtoestand: energie het laagst
- Excitatie: opnemen licht-energie door fluorochroom
Hogere energie-toestand (aangeslagen toestand)
- Emissie: Bij het terugvallen naar de grondtoestand komt de opgenomen energie vrij onder licht
Gedeelte van de energie gaat verloren
- Golflengte excitatie ≠ Golflengte emissie
, P85!
Diagnostiek
H0: Situering van de moleculaire diagnostiek
0.1 Wat zijn moleculaire testen?
= Gespecialiseerde technieken die in het moleculairbiologisch labo worden gebruikt om rechtstreeks het erfelijk
materiaal (DNA / RNA) van menselijke cellen of micro-organismen te onderzoeken.
DNA-hybridisatie:
- Doelwit-DNA wordt gekoppeld met een DNA-probe
Probe evt. gekoppeld met fluorescerende molecule (visualisatie bij FISH)
- Niet zo gevoelig als DNA-amplificatie
DNA-amplificatie:
- Een deeltje van het DNA wordt exponentieel gekopieerd
- PCR en real-time PCR
- Enorm gevoelig
Dus ook vatbaar voor contaminatie
Sequencing:
- De exacte sequentie van een bepaald gen achterhalen om erfelijke ziektes of aandoeningen op te sporen
die veroorzaakt worden door mutaties in het genetische materiaal
- Kankers en mutaties opsporen
IVD-kits:
- In vitro diagnostics
- Commerciële testen / CE-marketing
RUO:
- Research only
- Commerciële kits
- Enkel aangeraden op dat moment voor het gebruik in het onderzoek
Home-brew: thuistesten
Volautomaten: robots, …
Voordelen van moleculaire testen:
- Hoge gevoeligheid
= percentage aan positieven in de groep van zieke mensen
Lage hoeveelheid materiaal nodig voor de detectie
- Specificiteit
= percentage van negatieven in de groep van de niet zieke mensen
- Snelle rapportering
Nadelen van moleculaire testen:
- PCR: contaminatie gevoelig
Kwaliteitscontrole is belangrijk
,0.2 Domeinen in de moleculaire diagnostiek
Erfelijke genetische afwijkingen:
Afwijkingen in het menselijk genetische materiaal die erfelijk zijn
Constitutioneel genetische afwijkingen
Centrum voor menselijke erfelijkheid (4 in Vlaanderen)
- Onderzoekt erfelijk karakter van aandoeningen
- Ontwikkelt technieken om erfelijke ziekten en / of handicaps te voorkomen
Verworven genetische afwijkingen:
Afwijkingen in het menselijke genetische materiaal die verworven zijn
Verworven genetische afwijkingen
Centrum voor moleculaire diagnostiek
- Verbonden aan het ziekenhuis
- Onderzoek naar mutaties verantwoordelijk voor het ontstaan van kanker
Infectieziekten:
Genetische materiaal van micro-organismen zoals bacteriën of virussen
Microbiologie, virologie of parasitologie
- Diagnose stellen
- Therapie van een infectie opvolgen
Gerechtelijke geneeskunde:
Variaties in het menselijke genetische materiaal van verschillende individuen
Forensisch onderzoek
- Variaties in genetische materiaal om bepaalde erfelijke aandoeningen te voorspellen
- Identificatie
, H1: Kwantitatieve PCR (qPCR)
1.1 qPCR en conventionele PCR
Conventionele PCR:
- Detectie tijdens de plateau fase
- Niet kwantitatief
qPCR / real time PCR:
- Detectie in real time
Elke cyclus hoeveelheid PCR product meten
- Kwantitatief
- PCR-producten gekoppeld aan fluorescerende stof of
probe
- # fluorescentie ~ # gevormde PCR product
Voordelen qPCR:
- PCR-product moet na afloop van de reactie niet meer geanalyseerd worden
Geen contaminatie
- Kwantificering van het startmateriaal is mogelijk
- Meerdere kleuren fluorescentie kunnen gedetecteerd worden
Multiplex
a)
1: Target denatureren
2: Annealingsfase: primers binden
3: Extensie-fase:
- PCR-product wordt gemaakt
- Ontstaan fluorescentiesignaal door binding
fluorescerende DNA-bindende kleurstoffen /
door
afbraak van de hydrolisatie-probe
b) Elke cyclus zal er meer PCR-product dus ook meer
fluorescentie aanwezig zijn.
c) Toename fluorescentie.
1e cycli: nauwelijks PCR-product, nauwelijks
fluorescentie
na aantal cycli: # PCR-product stijgt, fluorescentie stijgt
na 20-40 cycli: reactiecomponenten raken uitgeput,
nauwelijks toename van PCR-product, nauwelijks fluorescentie
= plateaufase
1.2 Fluorescentie
qPCR Fluorescentie
Fluorochromen = moleculen die energie in de vorm van licht kunnen opnemen
- Grondtoestand: energie het laagst
- Excitatie: opnemen licht-energie door fluorochroom
Hogere energie-toestand (aangeslagen toestand)
- Emissie: Bij het terugvallen naar de grondtoestand komt de opgenomen energie vrij onder licht
Gedeelte van de energie gaat verloren
- Golflengte excitatie ≠ Golflengte emissie
, P85!
