Infectie & Immuniteit: practica
Voorbereidende e-module PR fagocytose
- Fagocytose is het proces van het opnemen van vaste deeltjes in een cel door deze te
omsluiten met een membraan. Zodoende wordt een holte binnen de cel gevormd die men
een fagosoom noemt. Hierin wordt onafbreekbaar materiaal veilig opgeslagen, maar vooral
ook opgenomen ziekteverwekkers en eiwitten afgebroken.
- Bloed bestaat zowel uit een cellulaire als een vloeibare fractie. Deze fracties zijn van elkaar
te scheiden door middel van centrifugatie.
o Onder in de buis komen de witte en rode bloedcellen en bloedplaatjes terecht,
daarbovenop de vloeibare fractie met opgeloste moleculen (albumine, antistoffen,
stollingsfactoren, complement, etc.). Deze fractie wordt plasma genoemd.
o Wanneer men het bloed laat stollen en nadien centrifugeert, blijft serum over.
- Afbeelding hierboven:
o A: basofiele granulocyt
o B: eosinofiele granulocyt
o C: lymfocyt
o D: monocyt
o E: neutrofiele granulocyt
- Om erytrocyten te verwijderen en verschillende typen witte bloedcellen verder te zuiveren
maakt men gebruik van een verschil in soortelijk gewicht en gevoeligheid voor osmotische
shock van de verschillende bloedcellen.
- Verstoring door ongehepariniseerd bloed te gebruiken in het practicum:
o Er kan niet worden gewerkt met gestold bloed, zo kan het bv niet worden
gepipetteerd.
o Stolsels kunnen interfereren met het middel (Ficoll-Paque) dat is gebruikt om te
scheiden op soortelijk gewicht.
▪ De vorm en grootte van de stolsels zorgen ervoor dat ze met de lange
polymeren van Ficoll verstrengeld kunnen raken. Hierdoor vindt de
scheiding van de bloedcellen op soortelijke dichtheid niet meer goed plaats.
- Na toevoeging van verdund heparinebloed aan Ficoll-Paque, worden de buizen
gecentrifugeerd.
o Het soortelijk gewicht van granulocyten is hoger dan dat van Ficoll dus deze cellen
komen onderin de buis (samen met de erytrocyten).
~1~
, 1
2
w
- De laag Ficoll-Paque™ Plus wordt volledig afgezogen m.b.v. een plastic Pasteurse pipet.
2 gelyseerd m.b.v. shock buffer.
Vervolgens worden de erytrocyten
o Protocol:
▪ Resuspendeer het granulocytenpellet in 5 mL ijskoude shock buffer.
▪ Vul aan met shock buffer tot 25 mL.
▪ Laat het buisje 3-5 min op smeltend ijs, al schuddend.
▪ Als de lysis voltooid is, vul de buis aan tot 50 mL met ijskoude RPMI 1640
(met HEPES buffer) + BSA.
▪ Meng direct en centrifugeer (300 g, 10 min (4ºC!)).
▪ Schenk het supernatant voorzichtig af.
▪ Resuspendeer het pellet.
o De lysis vindt plaats door lage osmotische waarde in het mengsel. De erythrocyten
zullen hierdoor lyseren. Er zijn geen moleculen aanwezig in de shock buffer die een
lysis actief induceren.
o De HEPES buffer zorgt voor het in stand houden van een fysiologische pH.
o De grote hoeveelheid plasma-eiwitten in BSA verhogen de osmotische waarde van
het mengsel zodanig dat de hypotone shock opgeheven wordt.
- Humorale immuniteit beschrijft het aspect van het immuunsysteem dat gemedieerd wordt
door macromoleculen in de extracellulaire vloeistof. Dit zijn bijvoorbeeld antilichamen en
complement-eiwitten.
- Voor een efficiënte fagocytose zijn opsonines nodig
o Een opsonine is een oplosbaar, fagocytose-stimulerend eiwit. Ze worden ook wel
soluble Pattern Recognition Proteins (PRP) genoemd.
▪ Voorbeelden: mannose-bindend lectin (MBL), C-reactive protein (CRP) en
het complementeiwit C1q
o De functie van opsonisatie is het stimuleren van fagocytose.
- Tijdens bacteriële ontstekingen treedt ook een ‘linksverschuiving’ in het granulocytenbeeld
op.
o Linksverschuiving betekent een toename van onrijpere neutrofielen.
▪ Wanneer 10% of meer staafvormig is (nog geen gesegmenteerde kern).
o Via twee mechanismen vindt er een linkverschuiving plaats:
▪ Rijpe neutrofielen sterven lokaal bij de bacteriële ontsteking
▪ Het beenmerg wordt gestimuleerd tot de uitstoot van meer, nog onrijpe,
neutrofielen
Deficiënties fagocytose
- Neutropenie: te weinig neutrofiele granulocyten aanwezig in het lichaam.
~2~
, o Wanneer iemand bv behandeld wordt met chemotherapie: dit doodt alle snel-
delende cellen
- Complement factor 3 deficiëntie: (zie linksonder)
o Bij deze patiënten ontbreken de klassieke én alternatieve complement
activatieroute.
o Hierdoor ontbreken de opsonines waardoor de bacteriën niet meer goed worden
herkend en zijn ook de chemotactische activiteiten van het complement (zoals C3a
en C5a) niet meer aanwezig.
▪ Door de chemotactische activiteit worden fagocyten (normaal gesproken)
aangetrokken naar de infectiehaard.
- Leukocyten adhesie deficiëntie type: (zie rechtsboven)
o Leukocyten missen bepaalde adhesiemoleculen (integrines) op de plasmamembraan
of er zijn mutaties in deze integrines.
▪ Deze adhesiemoleculen zijn belangrijk bij de extravasatie van onder andere
fagocyten naar de bacteriën.
▪ Daarnaast spelen deze receptoren een rol bij de binding aan opsonines.
- Myeloperoxidase deficientie:
o Fagocyten kunnen geen myeloperoxidase maken: hierdoor kan de degradatie van de
bacterie niet meer plaatsvinden (stap 6).
- Ziekte van Chediak-Higashi:
o Fagocyten hebben “reuze-lysosomen” door een defect in het lysosomaal
transportsysteem (stap 5).
- Chronische granulomateuze ziekte:
o Fagocyten kunnen geen actieve zuurstofmetabolieten en waterstofperoxide maken.
De intracellulaire killing kan zo niet plaatsvinden en de ziekteverwekker wordt niet
opgeruimd (stap 5 en 6). Het lichaam kapselt vervolgens de besmette cellen in om
verspreiding te voorkomen.
Bijdragen van het verworven systeem bij een bacteriële infectie
- Bij een tweede infectie speelt ook de verworven arm van het immuunsysteem een
belangrijke rol. Het verworven immuunsysteem is specifieker dan de aangeboren tak en
zorgt voor snellere en efficiëntere klaring van reeds meegemaakte infecties.
- B-cellen zijn lymfocyten, net zoals T-cellen. B-lymfocyten produceren antilichamen.
o Een ander woord voor immunoglobulines is antilichamen.
o Antilichamen dienen niet verward te worden met antigenen, lichaamseigen of –
vreemde deeltjes, meestal eiwitten. Antilichamen herkennen heel specifiek één
antigeen.
~3~
Voorbereidende e-module PR fagocytose
- Fagocytose is het proces van het opnemen van vaste deeltjes in een cel door deze te
omsluiten met een membraan. Zodoende wordt een holte binnen de cel gevormd die men
een fagosoom noemt. Hierin wordt onafbreekbaar materiaal veilig opgeslagen, maar vooral
ook opgenomen ziekteverwekkers en eiwitten afgebroken.
- Bloed bestaat zowel uit een cellulaire als een vloeibare fractie. Deze fracties zijn van elkaar
te scheiden door middel van centrifugatie.
o Onder in de buis komen de witte en rode bloedcellen en bloedplaatjes terecht,
daarbovenop de vloeibare fractie met opgeloste moleculen (albumine, antistoffen,
stollingsfactoren, complement, etc.). Deze fractie wordt plasma genoemd.
o Wanneer men het bloed laat stollen en nadien centrifugeert, blijft serum over.
- Afbeelding hierboven:
o A: basofiele granulocyt
o B: eosinofiele granulocyt
o C: lymfocyt
o D: monocyt
o E: neutrofiele granulocyt
- Om erytrocyten te verwijderen en verschillende typen witte bloedcellen verder te zuiveren
maakt men gebruik van een verschil in soortelijk gewicht en gevoeligheid voor osmotische
shock van de verschillende bloedcellen.
- Verstoring door ongehepariniseerd bloed te gebruiken in het practicum:
o Er kan niet worden gewerkt met gestold bloed, zo kan het bv niet worden
gepipetteerd.
o Stolsels kunnen interfereren met het middel (Ficoll-Paque) dat is gebruikt om te
scheiden op soortelijk gewicht.
▪ De vorm en grootte van de stolsels zorgen ervoor dat ze met de lange
polymeren van Ficoll verstrengeld kunnen raken. Hierdoor vindt de
scheiding van de bloedcellen op soortelijke dichtheid niet meer goed plaats.
- Na toevoeging van verdund heparinebloed aan Ficoll-Paque, worden de buizen
gecentrifugeerd.
o Het soortelijk gewicht van granulocyten is hoger dan dat van Ficoll dus deze cellen
komen onderin de buis (samen met de erytrocyten).
~1~
, 1
2
w
- De laag Ficoll-Paque™ Plus wordt volledig afgezogen m.b.v. een plastic Pasteurse pipet.
2 gelyseerd m.b.v. shock buffer.
Vervolgens worden de erytrocyten
o Protocol:
▪ Resuspendeer het granulocytenpellet in 5 mL ijskoude shock buffer.
▪ Vul aan met shock buffer tot 25 mL.
▪ Laat het buisje 3-5 min op smeltend ijs, al schuddend.
▪ Als de lysis voltooid is, vul de buis aan tot 50 mL met ijskoude RPMI 1640
(met HEPES buffer) + BSA.
▪ Meng direct en centrifugeer (300 g, 10 min (4ºC!)).
▪ Schenk het supernatant voorzichtig af.
▪ Resuspendeer het pellet.
o De lysis vindt plaats door lage osmotische waarde in het mengsel. De erythrocyten
zullen hierdoor lyseren. Er zijn geen moleculen aanwezig in de shock buffer die een
lysis actief induceren.
o De HEPES buffer zorgt voor het in stand houden van een fysiologische pH.
o De grote hoeveelheid plasma-eiwitten in BSA verhogen de osmotische waarde van
het mengsel zodanig dat de hypotone shock opgeheven wordt.
- Humorale immuniteit beschrijft het aspect van het immuunsysteem dat gemedieerd wordt
door macromoleculen in de extracellulaire vloeistof. Dit zijn bijvoorbeeld antilichamen en
complement-eiwitten.
- Voor een efficiënte fagocytose zijn opsonines nodig
o Een opsonine is een oplosbaar, fagocytose-stimulerend eiwit. Ze worden ook wel
soluble Pattern Recognition Proteins (PRP) genoemd.
▪ Voorbeelden: mannose-bindend lectin (MBL), C-reactive protein (CRP) en
het complementeiwit C1q
o De functie van opsonisatie is het stimuleren van fagocytose.
- Tijdens bacteriële ontstekingen treedt ook een ‘linksverschuiving’ in het granulocytenbeeld
op.
o Linksverschuiving betekent een toename van onrijpere neutrofielen.
▪ Wanneer 10% of meer staafvormig is (nog geen gesegmenteerde kern).
o Via twee mechanismen vindt er een linkverschuiving plaats:
▪ Rijpe neutrofielen sterven lokaal bij de bacteriële ontsteking
▪ Het beenmerg wordt gestimuleerd tot de uitstoot van meer, nog onrijpe,
neutrofielen
Deficiënties fagocytose
- Neutropenie: te weinig neutrofiele granulocyten aanwezig in het lichaam.
~2~
, o Wanneer iemand bv behandeld wordt met chemotherapie: dit doodt alle snel-
delende cellen
- Complement factor 3 deficiëntie: (zie linksonder)
o Bij deze patiënten ontbreken de klassieke én alternatieve complement
activatieroute.
o Hierdoor ontbreken de opsonines waardoor de bacteriën niet meer goed worden
herkend en zijn ook de chemotactische activiteiten van het complement (zoals C3a
en C5a) niet meer aanwezig.
▪ Door de chemotactische activiteit worden fagocyten (normaal gesproken)
aangetrokken naar de infectiehaard.
- Leukocyten adhesie deficiëntie type: (zie rechtsboven)
o Leukocyten missen bepaalde adhesiemoleculen (integrines) op de plasmamembraan
of er zijn mutaties in deze integrines.
▪ Deze adhesiemoleculen zijn belangrijk bij de extravasatie van onder andere
fagocyten naar de bacteriën.
▪ Daarnaast spelen deze receptoren een rol bij de binding aan opsonines.
- Myeloperoxidase deficientie:
o Fagocyten kunnen geen myeloperoxidase maken: hierdoor kan de degradatie van de
bacterie niet meer plaatsvinden (stap 6).
- Ziekte van Chediak-Higashi:
o Fagocyten hebben “reuze-lysosomen” door een defect in het lysosomaal
transportsysteem (stap 5).
- Chronische granulomateuze ziekte:
o Fagocyten kunnen geen actieve zuurstofmetabolieten en waterstofperoxide maken.
De intracellulaire killing kan zo niet plaatsvinden en de ziekteverwekker wordt niet
opgeruimd (stap 5 en 6). Het lichaam kapselt vervolgens de besmette cellen in om
verspreiding te voorkomen.
Bijdragen van het verworven systeem bij een bacteriële infectie
- Bij een tweede infectie speelt ook de verworven arm van het immuunsysteem een
belangrijke rol. Het verworven immuunsysteem is specifieker dan de aangeboren tak en
zorgt voor snellere en efficiëntere klaring van reeds meegemaakte infecties.
- B-cellen zijn lymfocyten, net zoals T-cellen. B-lymfocyten produceren antilichamen.
o Een ander woord voor immunoglobulines is antilichamen.
o Antilichamen dienen niet verward te worden met antigenen, lichaamseigen of –
vreemde deeltjes, meestal eiwitten. Antilichamen herkennen heel specifiek één
antigeen.
~3~
