B05MBO Plan van Aanpak
Klonering van GOI
Naam:
Studentennummer:
Klas:
Docent:
Datum: 26-9-2023
,Inhoud
Kloneringsstrategie.................................................................................................................................2
1. Kloneringsstappen..........................................................................................................................2
2. Identificatie CDS..............................................................................................................................2
3. Vectorkaart lege plasmide..............................................................................................................3
8. Primerontwerp...............................................................................................................................5
9. Vectorkaart gekloneerd plasmide...................................................................................................6
Uitvoering...............................................................................................................................................6
10. PCR template................................................................................................................................7
11. PCR programma............................................................................................................................7
12. Validatie DNA................................................................................................................................8
13. Validatie eiwit...............................................................................................................................9
14. Eiwitzuivering...............................................................................................................................9
Referenties............................................................................................................................................10
Bijlagen.................................................................................................................................................11
Bijlage 1: Complete mRNA sequentie + CDS.....................................................................................11
Bijlage 2: DNA sequentie plasmide (Zonder GOI)..............................................................................12
Bijlage 3: DNA sequentie plasmide na klonering (Met GOI)..............................................................13
Bijlage 4: Plasmide na klonering (Getransleerd)...............................................................................15
1
, Kloneringsstrategie
1. Kloneringsstappen
Als eerst zal er cDNA gemaakt moeten worden van het mRNA. Dit wordt gedaan met behulp van het
enzym “Reverse transcriptase”. Dit moet gedaan worden omdat er dan PCR uitgevoerd kan worden
op het cDNA. Het cDNA bevat het gen van interesse (GOI). Om een PCR uit te voeren, heb je naast
template DNA ook primers nodig. De tweede stap in het kloneringsproces is hierom het ontwerpen
van deze primers. Vervolgens zal er een PCR uitgevoerd worden op het cDNA. Omdat de primers
specifiek zijn ontworpen om de CDS van het eiwit van interesse te amplificeren, zullen er veel kopieën
ontstaan van de CDS. Door het PCR-product te ligeren in een plasmide, ontstaat een construct dat je
kunt gebruiken in de volgende stappen van je klonering. Voordat je het PCR-product kan ligeren in het
plasmide, zal er eerst een digestie uitgevoerd moeten worden met behulp van restrictie-enzymen. Dit
is dan ook de volgende stap in de klonering. De restrictie-enzymen knippen in de MCS van het
plasmide, waardoor “plakrandjes” ontstaan. De restrictiesites van deze restrictie-enzymen zijn ook
toegevoegd aan de 5’ kant van de primers voor PCR. De digestie wordt dan ook uitgevoerd op het
PCR-product, waardoor de plakrandjes van het PCR-product en de plasmide perfect op elkaar passen.
Als laatste stap zal door middel van het enzym ligase het PCR-product en het plasmide aan elkaar
geplakt worden. Hierdoor ontstaat een construct dat een fusie-eiwit bevat met een 6xHis tag, het
GOI, en een fluorescent eiwit.
2. Identificatie CDS
Voor dit onderzoek is de sequentie van een onbekend GOI verkregen uit een humaan biopt van een
tumor. Deze sequentie (Sequentie L) is als volgt:
gacactgaga ctgagggtgt gcccagtact gccatccgag agatctctct gcttaaggag cttaaccatc ctaatattgt
Als eerst werd deze sequentie werd vergeleken met een database met behulp van NucleotideBLAST,
waaruit bleek dat deze sequentie 100% overeenkomt met de sequentie voor “Homo sapiens Cyclin
Dependent Kinase 2, transcript variant 2, mRNA”, ook wel CDK2 genoemd. Het NM-nummer van dit
resultaat is NM_052827.4. Vervolgens is het proteinID en de CDS van het eiwit opgezocht op de
pagina van het NM-nummer. Het proteinID is NP_439892.2. In bijlage 1 staat de volledige sequentie.
Voor deze stappen is NucleotideBLAST gebruikt, van de website van National Center for
Biotechnology Information (NCBI) [1].
Om CDK2 verder te kunnen onderzoeken, zullen we het GOI moeten toevoegen aan een plasmide.
Hiervoor wordt plasmide “p3” gebruikt. De sequentie van het plasmide is terug te vinden in bijlage 2.
2
Klonering van GOI
Naam:
Studentennummer:
Klas:
Docent:
Datum: 26-9-2023
,Inhoud
Kloneringsstrategie.................................................................................................................................2
1. Kloneringsstappen..........................................................................................................................2
2. Identificatie CDS..............................................................................................................................2
3. Vectorkaart lege plasmide..............................................................................................................3
8. Primerontwerp...............................................................................................................................5
9. Vectorkaart gekloneerd plasmide...................................................................................................6
Uitvoering...............................................................................................................................................6
10. PCR template................................................................................................................................7
11. PCR programma............................................................................................................................7
12. Validatie DNA................................................................................................................................8
13. Validatie eiwit...............................................................................................................................9
14. Eiwitzuivering...............................................................................................................................9
Referenties............................................................................................................................................10
Bijlagen.................................................................................................................................................11
Bijlage 1: Complete mRNA sequentie + CDS.....................................................................................11
Bijlage 2: DNA sequentie plasmide (Zonder GOI)..............................................................................12
Bijlage 3: DNA sequentie plasmide na klonering (Met GOI)..............................................................13
Bijlage 4: Plasmide na klonering (Getransleerd)...............................................................................15
1
, Kloneringsstrategie
1. Kloneringsstappen
Als eerst zal er cDNA gemaakt moeten worden van het mRNA. Dit wordt gedaan met behulp van het
enzym “Reverse transcriptase”. Dit moet gedaan worden omdat er dan PCR uitgevoerd kan worden
op het cDNA. Het cDNA bevat het gen van interesse (GOI). Om een PCR uit te voeren, heb je naast
template DNA ook primers nodig. De tweede stap in het kloneringsproces is hierom het ontwerpen
van deze primers. Vervolgens zal er een PCR uitgevoerd worden op het cDNA. Omdat de primers
specifiek zijn ontworpen om de CDS van het eiwit van interesse te amplificeren, zullen er veel kopieën
ontstaan van de CDS. Door het PCR-product te ligeren in een plasmide, ontstaat een construct dat je
kunt gebruiken in de volgende stappen van je klonering. Voordat je het PCR-product kan ligeren in het
plasmide, zal er eerst een digestie uitgevoerd moeten worden met behulp van restrictie-enzymen. Dit
is dan ook de volgende stap in de klonering. De restrictie-enzymen knippen in de MCS van het
plasmide, waardoor “plakrandjes” ontstaan. De restrictiesites van deze restrictie-enzymen zijn ook
toegevoegd aan de 5’ kant van de primers voor PCR. De digestie wordt dan ook uitgevoerd op het
PCR-product, waardoor de plakrandjes van het PCR-product en de plasmide perfect op elkaar passen.
Als laatste stap zal door middel van het enzym ligase het PCR-product en het plasmide aan elkaar
geplakt worden. Hierdoor ontstaat een construct dat een fusie-eiwit bevat met een 6xHis tag, het
GOI, en een fluorescent eiwit.
2. Identificatie CDS
Voor dit onderzoek is de sequentie van een onbekend GOI verkregen uit een humaan biopt van een
tumor. Deze sequentie (Sequentie L) is als volgt:
gacactgaga ctgagggtgt gcccagtact gccatccgag agatctctct gcttaaggag cttaaccatc ctaatattgt
Als eerst werd deze sequentie werd vergeleken met een database met behulp van NucleotideBLAST,
waaruit bleek dat deze sequentie 100% overeenkomt met de sequentie voor “Homo sapiens Cyclin
Dependent Kinase 2, transcript variant 2, mRNA”, ook wel CDK2 genoemd. Het NM-nummer van dit
resultaat is NM_052827.4. Vervolgens is het proteinID en de CDS van het eiwit opgezocht op de
pagina van het NM-nummer. Het proteinID is NP_439892.2. In bijlage 1 staat de volledige sequentie.
Voor deze stappen is NucleotideBLAST gebruikt, van de website van National Center for
Biotechnology Information (NCBI) [1].
Om CDK2 verder te kunnen onderzoeken, zullen we het GOI moeten toevoegen aan een plasmide.
Hiervoor wordt plasmide “p3” gebruikt. De sequentie van het plasmide is terug te vinden in bijlage 2.
2
