Hoofdstuk 3, onderzoeken van eiwitten en proteomen
Inleiding
Purificatie, om een eiwit te onderzoeken wil je het van zijn omgeving scheiden. De eerste stap in het
onderzoek naar eiwitten is dan ook meestal purificatie. Dit kan plaatsvinden op basis van
oplosbaarheid, grootte, lading en binding mogelijkheid.
Antilichamen, nadat en eiwit gepurificeerd is en zijn identiteit achterhaald is, moet zijn functie nog
achterhaald worden. Antilichamen kunnen gebruikt worden om eiwitten in vivo te lokaliseren.
Proteoom, het proteoom kan van cel tot cel verschillen. Dit beslaat de eiwitten die tot uiting komen.
Het verschilt niet alleen per celtype, maar ook per ontwikkelingsstadium en omgeving condities (bv
hormonen).
Proteoom & genoom, het proteoom is veel groter dan het genoom, want één gen kan voor
meerdere eiwitten coderen. Zo worden ze vaak nog gemodificeerd of vormen ze complexen. Waar
het genoom dus statisch is, is het proteoom erg dynamisch. Volgens de e-module is het proteoom de
som aan functionerende eiwitten in de cel en hun interacties.
3.1 De purificatie van eiwitten is een essentiële eerste stap in het begrijpen van hun
functie
Pure eiwitten, vanuit pure eiwitten kan de aminozuursequentie bepaald worden en de biochemische
functie onderzocht worden.
Aminozuursequentie, kan gebruikt worden om evolutionaire relaties tussen eiwitten van diverse
organismen te onderzoeken.
Purificatie, kan gedaan worden door het mengsel een serie scheidingen te laten ondergaan
gebaseerd op fysische eigenschappen zoals grootte en lading.
Assay, om het succes van een purificatie te testen moet een test gedaan worden, ook wel assay, voor
een unieke identificerende eigenschap van het eiwit dat je op wil zuiveren. Hoe specifieker de assay
is, hoe effectiever de purificatie. Als je assay positief is, weet je dat je betreffende eiwit nog in het
mengsel aanwezig is.
Enzym activiteit, voor enzymen bestaat de assay meestal uit het meten van enzym activiteit. Dat is
de mogelijkheid van het enzym om een bepaalde chemische reactie te promoten. Dit wordt vaak
indirect gedaan. Zo kan het zijn dat een van de producten van de reactie licht van een bepaalde
golflengte absorbeert, terwijl de beginstoffen dat niet doen. Door dan te kijken naar de ontwikkeling
van lichtabsorptie vermogen in een bepaalde tijd, bv 1 minuut, kan je een assay uitvoeren. Het assay
voor enzymactiviteit tijdens de purificatie van bijvoorbeeld lactaat dehydrogenase is de toename in
absorptie van licht van 340 nm in 1 minuut.
Eiwit concentratie, is een tweede eigenschap van het mengsel dat belangrijk is om je purificatie
schema te analyseren.
Specific activity, kan bepaald worden aan de hand van de enzym activiteit en eiwit concentratie. De
specifieke activiteit is de ratio van enzym activiteit ten opzichte van de totale hoeveelheid eiwitten in
het mengsel. Bij een goede purificatie schema zou deze moeten stijgen en het algemene doel van je
purificatie is het maximaliseren van de specifieke activiteit. Voor een puur enzym heeft de specific
activity een constante waarde.
Fractioneren, nadat je een geschikte assay hebt bedacht en een bron van eiwitten hebt gekozen,
moet de cel in componenten gefractioneerd worden. Je moet erachter komen in welk component
jouw eiwit zit.
Homogenate, eerst wordt er een homogenaat gevormd door het celmembraan te verstoren.
Centrifugatie, na homogenatie vindt centrifugatie plaats. Hierbij wordt een dicht pellet verkregen
van zware materialen op de bodem en een lichter supernatant erboven.
Differential centrifugation, het supernatant dat na de eerste centrifuge verkregen is, wordt
vervolgens met een sterkere kracht nog een keer gecentrifugeerd om een nieuw pellet en
supernatant op te leveren. Dit wordt meerdere malen gedaan en levert meerdere fracties met
,afnemende dichtheid. Elke fractie bevat steeds honderden verschillende eiwitten. De fracties worden
dan elk getest (assayed) voor de gewilde activiteit. Normaal gesproken is er dan één fractie die
verrijkt is met de betreffende activiteit en deze dient dan als bronmateriaal waarop meer-
onderscheidende purificatie technieken toegepast worden.
Purificatie eigenschappen, eiwitten worden vaak in actieve vorm gescheiden op basis van
oplosbaarheid, grootte, lading en specifieke bindingsaffiniteit. Meestal vinden er meerdere
purificaties na elkaar plaats en na elke purificatie wordt een assay gedaan om de specifieke activiteit
te meten. Hieronder volgen meerdere purificatie technieken:
- Salting out, de meeste eiwitten zijn minder oplosbaar bij hoge zoutgehaltes, een effect genaamd
salting out. De zoutconcentratie waarbij een eiwit neerslaat verschilt per eiwit en kan dus gebruikt
worden om eiwitten te fractioneren. Salting out kan ook gebruikt worden om verdunde oplossingen
te concentreren. Vervolgens kan dialyse uitgevoerd worden om het zout te verwijderen.
- Dialyse, eiwitten kunnen van kleine eiwitten, zoals zouten, gescheiden worden middels dialyse door
een semipermeabel membraan. Denk hierbij bijvoorbeeld aan een cellulose membraan met poriën.
Het eiwitmengsel wordt in een dialysezakje geplaatst en vervolgens in een buffer oplossing geplaatst
die geen kleine moleculen bevat, waardoor deze uit de zak zullen diffunderen.
- Gelfiltratie chromatografie, deze techniek scheidt
net als dialyse op grootte maar heeft een groter
onderscheidend vermogen. Gelfiltratie
chromatografie staat ook wel bekend als molecular
exclusion chromatography. Hierbij wordt een sample
aan de top van een kolom toegebracht die bestaat
uit poreuze beads. Kleine moleculen kunnen deze
beads binnen treden, maar de grote niet. Grote
moleculen stromen/lopen hierdoor sneller door de
kolom, omdat ze een kleiner volume tot hun
beschikking hebben.
Beads, de beads die bij bovenstaande techniek
gebruikt worden zijn onoplosbaar en bestaan uit
gehydrateerde polymeren van dextran, polyacrylamide of agarose.
- Ion-exchange chromatografie, middels deze techniek kunnen eiwitten gescheiden worden op hun
netto lading. Een eiwit dat bij pH 7 positief geladen is, zal waarschijnlijk aan beads blijven hangen die
carboxylaat groepen (COO-) bevatten, maar een negatief geladen eiwit niet. De gebonden eiwitten
kunnen vervolgens losgemaakt worden door de concentratie natriumchloride of een ander zout toe
te laten nemen in de eluting buffer. Zouten competeren met de positief geladen groepen van de
eiwitten voor het binden aan de kolom. Eiwitten die een lage hoeveelheid positieve groepen
bevatten, zullen eerst loskomen, waarna degene met veel groepen zullen volgen.
Cation exchange, bovengenoemde beschrijven van ion exchange chromatografie wordt ook wel
cation exchange genoemd om aan te geven dat positief geladen groepen aan de anion beads zullen
binden.
Anion exchange, negatief geladen eiwitten kunnen gescheiden worden middels anion exchange
waarbij een positief geladen kolom gebruikt wordt.
- Affiniteit chromatografie, is een krachtige methode om eiwitten te scheiden die erg selectief zijn
voor bepaalde eiwitten of chemische groepen. Zo heeft concanavalin A een hoge affiniteit voor
glucose en wanneer een ruw extract door een kolom gestuurd wordt met beads die covalent glucose
gebonden hebben, zal concanavalin A aan de beads binden en andere eiwitten niet. Concanavalin A
kan vervolgens van de beads gehaald worden door een hoog geconcentreerde glucose oplossing
langs de kolom te laten lopen. Deze methode kan ook gebruikt worden om transcriptiefactoren te
scheiden, door specifieke DNA sequenties aan de beads te zetten. De transcriptiefactoren kunnen
vervolgens losgemaakt worden door een hoge concentratie zout erlangs te laten lopen.
Gebruik affiniteit chromatografie, het kan effectief gebruikt worden om een eiwit te isoleren dat
groep X herkent door (1) groep X of een afgeleide ervan covalent aan de kolom te binden; (2) een mix
, van eiwitten aan de kolom toe te voegen die vervolgens met een buffer gespoeld wordt om de
ongebonden eiwitten uit te spoelen; en (3) tot slot kan het gewilde eiwit vrijgemaakt worden door
een hoge concentratie van een oplosbare vorm van X toe te voegen. Deze methode is het meest
effectief als de interactie van het eiwit en molecuul erg specifiek is.
Gekloneerde genen, affiniteitschromatografie kan gebruikt worden om eiwitten te isoleren die door
gekloneerde genen gecodeerd worden. Extra aminozuren worden door de gekloneerde genen
gecodeerd en als deze tot expressie komen, dienen zij als een affinity tag. Zo kan een Histidine tag
toegevoegd worden die bestaat uit meerdere histidines en in een kolom zullen zij aan metaalionen
binden.
- High performance liquid chromatography, ook wel HPLC, is een versterkte versie van de eerder
besproken kolom technieken. De kolommaterialen zijn fijner verdeeld en bezitten daardoor meer
interactie sites. Omdat de kolom van fijner materiaal gemaakt is, moet er druk op worden
uitgeoefend om een flow rate te verkrijgen. Het resultaat is een hoge resolutie en snelle scheiding.
Vaak wordt een monitor aan het einde van de kolom gezet die op 220 nm staat afgesteld. Dat is de
karakteristieke absorptie golflengte van peptidebindingen en levert meerdere pieken op.
Succes purificatieschema, je kan achterhalen of je purificaties effectief zijn door na elke stap de
specifieke activiteit te meten. Deze hoort dan toe te nemen. Er kan ook gekeken worden of het
aantal verschillende eiwitten afneemt in het sample.
Gelelektroforese, als DNA, RNA of eiwitten op een gel gezet worden die onder stroom staat, zullen
de macromoleculen zich gaan verplaatsen. De snelheid van migratie (𝑣) is afhankelijk van de sterkte
van het elektrische veld (𝐸), de netto lading van het molecuul (𝑧) en de frictie coëfficiënt (𝑓):
𝑣 = 𝐸𝑧/𝑓
De elektrische kracht 𝐸𝑧 die het geladen moleculen naar de andere kant van geladen elektrode
dwingt, wordt tegengegaan door de viscous drag 𝑓𝑣 die ontstaat door de frictie tussen het
bewegende molecuul en het medium.
Frictional coefficient, is afhankelijk van zowel de massa als vorm van het migrerende molecuul en de
viscositeit (𝜂) van het medium:
𝑓 = 𝜋𝜂𝑟
Poreuze gel, elektroforeses worden vaak op een poreuze gel uitgevoerd omdat die dan als
moleculaire zeef dient. Moleculen die t.o.v. de poriën in de gel klein zijn, zullen zich snel verplaatsen,
maar grote moleculen niet.
Elektrode, het elektrische veld wordt altijd zo aangebracht dat moleculen zich van de negatieve
elektrode naar de positieve elektrode verplaatsen. Meestal is dit van de top naar de bodem. De
polyacrylamide gel staat namelijk verticaal opgesteld.
Verschil gel filtratie & elektroforese, elektroforese verschilt van filtratie doordat er een elektrisch
veld gebruikt wordt, waardoor alle moleculen desondanks hun grootte, gedwongen worden om door
dezelfde matrix te verplaatsen.
SDS, eiwitten kunnen op basis van massa gescheiden worden door elektroforese in een
polyacrylamide gel onder denaturerende condities. Eerst wordt het eiwitmengsel blootgesteld aan
SDS (sodium dodecyl sulfate). Dit is aan anionic detergent die bijna alle niet-covalente interacties
verbreekt.
β-Mercaptoethanol, wordt aan het eiwitmengsel toegevoegd om de zwavelbruggen te verbreken.
Binding SDS, SDS bindt bijna elke twee aminozuren en draagt een negatieve lading bij zich. De lading
die hierdoor tot stand komt, is vele male groter dan die van het eiwit zelf en de bijdrage van het eiwit
zelf kan dus verwaarloosd worden. Het complex van SDS en gedenatureerde eiwit heeft een
negatieve lading die proportioneel is aan de massa van het eiwit.
Autoradiografie, de banden die ontstaan zijn kunnen gestained worden met zilvernitraat of een verf.
Als radioactieve labels gebruikt zijn, kan het bandenpatroon ook zichtbaar gemaakt worden door een
x-ray film over de gel heen te leggen.
SDS-page, de mobiliteit van de meeste polypeptideketens is lineair proportioneel aan hun massa in
het geval van SDS-page. Er zijn echter carbohydrate rijke eiwitten of membraaneiwitten die zich niet
aan deze regel houden.
Inleiding
Purificatie, om een eiwit te onderzoeken wil je het van zijn omgeving scheiden. De eerste stap in het
onderzoek naar eiwitten is dan ook meestal purificatie. Dit kan plaatsvinden op basis van
oplosbaarheid, grootte, lading en binding mogelijkheid.
Antilichamen, nadat en eiwit gepurificeerd is en zijn identiteit achterhaald is, moet zijn functie nog
achterhaald worden. Antilichamen kunnen gebruikt worden om eiwitten in vivo te lokaliseren.
Proteoom, het proteoom kan van cel tot cel verschillen. Dit beslaat de eiwitten die tot uiting komen.
Het verschilt niet alleen per celtype, maar ook per ontwikkelingsstadium en omgeving condities (bv
hormonen).
Proteoom & genoom, het proteoom is veel groter dan het genoom, want één gen kan voor
meerdere eiwitten coderen. Zo worden ze vaak nog gemodificeerd of vormen ze complexen. Waar
het genoom dus statisch is, is het proteoom erg dynamisch. Volgens de e-module is het proteoom de
som aan functionerende eiwitten in de cel en hun interacties.
3.1 De purificatie van eiwitten is een essentiële eerste stap in het begrijpen van hun
functie
Pure eiwitten, vanuit pure eiwitten kan de aminozuursequentie bepaald worden en de biochemische
functie onderzocht worden.
Aminozuursequentie, kan gebruikt worden om evolutionaire relaties tussen eiwitten van diverse
organismen te onderzoeken.
Purificatie, kan gedaan worden door het mengsel een serie scheidingen te laten ondergaan
gebaseerd op fysische eigenschappen zoals grootte en lading.
Assay, om het succes van een purificatie te testen moet een test gedaan worden, ook wel assay, voor
een unieke identificerende eigenschap van het eiwit dat je op wil zuiveren. Hoe specifieker de assay
is, hoe effectiever de purificatie. Als je assay positief is, weet je dat je betreffende eiwit nog in het
mengsel aanwezig is.
Enzym activiteit, voor enzymen bestaat de assay meestal uit het meten van enzym activiteit. Dat is
de mogelijkheid van het enzym om een bepaalde chemische reactie te promoten. Dit wordt vaak
indirect gedaan. Zo kan het zijn dat een van de producten van de reactie licht van een bepaalde
golflengte absorbeert, terwijl de beginstoffen dat niet doen. Door dan te kijken naar de ontwikkeling
van lichtabsorptie vermogen in een bepaalde tijd, bv 1 minuut, kan je een assay uitvoeren. Het assay
voor enzymactiviteit tijdens de purificatie van bijvoorbeeld lactaat dehydrogenase is de toename in
absorptie van licht van 340 nm in 1 minuut.
Eiwit concentratie, is een tweede eigenschap van het mengsel dat belangrijk is om je purificatie
schema te analyseren.
Specific activity, kan bepaald worden aan de hand van de enzym activiteit en eiwit concentratie. De
specifieke activiteit is de ratio van enzym activiteit ten opzichte van de totale hoeveelheid eiwitten in
het mengsel. Bij een goede purificatie schema zou deze moeten stijgen en het algemene doel van je
purificatie is het maximaliseren van de specifieke activiteit. Voor een puur enzym heeft de specific
activity een constante waarde.
Fractioneren, nadat je een geschikte assay hebt bedacht en een bron van eiwitten hebt gekozen,
moet de cel in componenten gefractioneerd worden. Je moet erachter komen in welk component
jouw eiwit zit.
Homogenate, eerst wordt er een homogenaat gevormd door het celmembraan te verstoren.
Centrifugatie, na homogenatie vindt centrifugatie plaats. Hierbij wordt een dicht pellet verkregen
van zware materialen op de bodem en een lichter supernatant erboven.
Differential centrifugation, het supernatant dat na de eerste centrifuge verkregen is, wordt
vervolgens met een sterkere kracht nog een keer gecentrifugeerd om een nieuw pellet en
supernatant op te leveren. Dit wordt meerdere malen gedaan en levert meerdere fracties met
,afnemende dichtheid. Elke fractie bevat steeds honderden verschillende eiwitten. De fracties worden
dan elk getest (assayed) voor de gewilde activiteit. Normaal gesproken is er dan één fractie die
verrijkt is met de betreffende activiteit en deze dient dan als bronmateriaal waarop meer-
onderscheidende purificatie technieken toegepast worden.
Purificatie eigenschappen, eiwitten worden vaak in actieve vorm gescheiden op basis van
oplosbaarheid, grootte, lading en specifieke bindingsaffiniteit. Meestal vinden er meerdere
purificaties na elkaar plaats en na elke purificatie wordt een assay gedaan om de specifieke activiteit
te meten. Hieronder volgen meerdere purificatie technieken:
- Salting out, de meeste eiwitten zijn minder oplosbaar bij hoge zoutgehaltes, een effect genaamd
salting out. De zoutconcentratie waarbij een eiwit neerslaat verschilt per eiwit en kan dus gebruikt
worden om eiwitten te fractioneren. Salting out kan ook gebruikt worden om verdunde oplossingen
te concentreren. Vervolgens kan dialyse uitgevoerd worden om het zout te verwijderen.
- Dialyse, eiwitten kunnen van kleine eiwitten, zoals zouten, gescheiden worden middels dialyse door
een semipermeabel membraan. Denk hierbij bijvoorbeeld aan een cellulose membraan met poriën.
Het eiwitmengsel wordt in een dialysezakje geplaatst en vervolgens in een buffer oplossing geplaatst
die geen kleine moleculen bevat, waardoor deze uit de zak zullen diffunderen.
- Gelfiltratie chromatografie, deze techniek scheidt
net als dialyse op grootte maar heeft een groter
onderscheidend vermogen. Gelfiltratie
chromatografie staat ook wel bekend als molecular
exclusion chromatography. Hierbij wordt een sample
aan de top van een kolom toegebracht die bestaat
uit poreuze beads. Kleine moleculen kunnen deze
beads binnen treden, maar de grote niet. Grote
moleculen stromen/lopen hierdoor sneller door de
kolom, omdat ze een kleiner volume tot hun
beschikking hebben.
Beads, de beads die bij bovenstaande techniek
gebruikt worden zijn onoplosbaar en bestaan uit
gehydrateerde polymeren van dextran, polyacrylamide of agarose.
- Ion-exchange chromatografie, middels deze techniek kunnen eiwitten gescheiden worden op hun
netto lading. Een eiwit dat bij pH 7 positief geladen is, zal waarschijnlijk aan beads blijven hangen die
carboxylaat groepen (COO-) bevatten, maar een negatief geladen eiwit niet. De gebonden eiwitten
kunnen vervolgens losgemaakt worden door de concentratie natriumchloride of een ander zout toe
te laten nemen in de eluting buffer. Zouten competeren met de positief geladen groepen van de
eiwitten voor het binden aan de kolom. Eiwitten die een lage hoeveelheid positieve groepen
bevatten, zullen eerst loskomen, waarna degene met veel groepen zullen volgen.
Cation exchange, bovengenoemde beschrijven van ion exchange chromatografie wordt ook wel
cation exchange genoemd om aan te geven dat positief geladen groepen aan de anion beads zullen
binden.
Anion exchange, negatief geladen eiwitten kunnen gescheiden worden middels anion exchange
waarbij een positief geladen kolom gebruikt wordt.
- Affiniteit chromatografie, is een krachtige methode om eiwitten te scheiden die erg selectief zijn
voor bepaalde eiwitten of chemische groepen. Zo heeft concanavalin A een hoge affiniteit voor
glucose en wanneer een ruw extract door een kolom gestuurd wordt met beads die covalent glucose
gebonden hebben, zal concanavalin A aan de beads binden en andere eiwitten niet. Concanavalin A
kan vervolgens van de beads gehaald worden door een hoog geconcentreerde glucose oplossing
langs de kolom te laten lopen. Deze methode kan ook gebruikt worden om transcriptiefactoren te
scheiden, door specifieke DNA sequenties aan de beads te zetten. De transcriptiefactoren kunnen
vervolgens losgemaakt worden door een hoge concentratie zout erlangs te laten lopen.
Gebruik affiniteit chromatografie, het kan effectief gebruikt worden om een eiwit te isoleren dat
groep X herkent door (1) groep X of een afgeleide ervan covalent aan de kolom te binden; (2) een mix
, van eiwitten aan de kolom toe te voegen die vervolgens met een buffer gespoeld wordt om de
ongebonden eiwitten uit te spoelen; en (3) tot slot kan het gewilde eiwit vrijgemaakt worden door
een hoge concentratie van een oplosbare vorm van X toe te voegen. Deze methode is het meest
effectief als de interactie van het eiwit en molecuul erg specifiek is.
Gekloneerde genen, affiniteitschromatografie kan gebruikt worden om eiwitten te isoleren die door
gekloneerde genen gecodeerd worden. Extra aminozuren worden door de gekloneerde genen
gecodeerd en als deze tot expressie komen, dienen zij als een affinity tag. Zo kan een Histidine tag
toegevoegd worden die bestaat uit meerdere histidines en in een kolom zullen zij aan metaalionen
binden.
- High performance liquid chromatography, ook wel HPLC, is een versterkte versie van de eerder
besproken kolom technieken. De kolommaterialen zijn fijner verdeeld en bezitten daardoor meer
interactie sites. Omdat de kolom van fijner materiaal gemaakt is, moet er druk op worden
uitgeoefend om een flow rate te verkrijgen. Het resultaat is een hoge resolutie en snelle scheiding.
Vaak wordt een monitor aan het einde van de kolom gezet die op 220 nm staat afgesteld. Dat is de
karakteristieke absorptie golflengte van peptidebindingen en levert meerdere pieken op.
Succes purificatieschema, je kan achterhalen of je purificaties effectief zijn door na elke stap de
specifieke activiteit te meten. Deze hoort dan toe te nemen. Er kan ook gekeken worden of het
aantal verschillende eiwitten afneemt in het sample.
Gelelektroforese, als DNA, RNA of eiwitten op een gel gezet worden die onder stroom staat, zullen
de macromoleculen zich gaan verplaatsen. De snelheid van migratie (𝑣) is afhankelijk van de sterkte
van het elektrische veld (𝐸), de netto lading van het molecuul (𝑧) en de frictie coëfficiënt (𝑓):
𝑣 = 𝐸𝑧/𝑓
De elektrische kracht 𝐸𝑧 die het geladen moleculen naar de andere kant van geladen elektrode
dwingt, wordt tegengegaan door de viscous drag 𝑓𝑣 die ontstaat door de frictie tussen het
bewegende molecuul en het medium.
Frictional coefficient, is afhankelijk van zowel de massa als vorm van het migrerende molecuul en de
viscositeit (𝜂) van het medium:
𝑓 = 𝜋𝜂𝑟
Poreuze gel, elektroforeses worden vaak op een poreuze gel uitgevoerd omdat die dan als
moleculaire zeef dient. Moleculen die t.o.v. de poriën in de gel klein zijn, zullen zich snel verplaatsen,
maar grote moleculen niet.
Elektrode, het elektrische veld wordt altijd zo aangebracht dat moleculen zich van de negatieve
elektrode naar de positieve elektrode verplaatsen. Meestal is dit van de top naar de bodem. De
polyacrylamide gel staat namelijk verticaal opgesteld.
Verschil gel filtratie & elektroforese, elektroforese verschilt van filtratie doordat er een elektrisch
veld gebruikt wordt, waardoor alle moleculen desondanks hun grootte, gedwongen worden om door
dezelfde matrix te verplaatsen.
SDS, eiwitten kunnen op basis van massa gescheiden worden door elektroforese in een
polyacrylamide gel onder denaturerende condities. Eerst wordt het eiwitmengsel blootgesteld aan
SDS (sodium dodecyl sulfate). Dit is aan anionic detergent die bijna alle niet-covalente interacties
verbreekt.
β-Mercaptoethanol, wordt aan het eiwitmengsel toegevoegd om de zwavelbruggen te verbreken.
Binding SDS, SDS bindt bijna elke twee aminozuren en draagt een negatieve lading bij zich. De lading
die hierdoor tot stand komt, is vele male groter dan die van het eiwit zelf en de bijdrage van het eiwit
zelf kan dus verwaarloosd worden. Het complex van SDS en gedenatureerde eiwit heeft een
negatieve lading die proportioneel is aan de massa van het eiwit.
Autoradiografie, de banden die ontstaan zijn kunnen gestained worden met zilvernitraat of een verf.
Als radioactieve labels gebruikt zijn, kan het bandenpatroon ook zichtbaar gemaakt worden door een
x-ray film over de gel heen te leggen.
SDS-page, de mobiliteit van de meeste polypeptideketens is lineair proportioneel aan hun massa in
het geval van SDS-page. Er zijn echter carbohydrate rijke eiwitten of membraaneiwitten die zich niet
aan deze regel houden.
