Les 1 Basisbegrippen voor scheidingsmethoden en gelfiltratie
Chromatografie wordt gebruikt om aparte bestanddelen te scheiden. Het principe hiervan is:
De scheiding van componenten op basis van affiniteit voor 2 fasen die niet mengbaar zijn.
Elk systeem bevat de volgende basiscomponenten:
- Stationaire fase: Een stilstaande fase: dit kan zowel vast als vloeibaar zijn.
- Chromatografisch bed: Waar de stationaire fase zich in bevindt (vaak een
glazen of metalen kolom)
- Mobiele fase: De bewegende fase: dit kan zowel vloeibaar als gas zijn.
- Delivery system: Het systeem dat ervoor zorgt dat de mobiele fase door
de stationaire fase gaat.
Voor chromatografische systemen geldt dat stoffen met een hoge affiniteit voor
de stationaire fase vertraagd worden in de kolom.
Er bestaan twee soorten van chromatografie:
Preparatief, hierbij is al bekend wat wordt gescheiden & analytisch, hierbij zijn
de te scheiden producten onbekend.
De scheidingsprincipes zijn: gelfiltratie, affiniteit, adsorptie, partitie of ion-uitwisseling.
Dunne laag chromatografie:
Hierbij wordt er een dunne laag van een absorberend materiaal in een klein laagje
oplosmiddel gehouden. Door aan de dunne laag te onderzoeken stoffen toe te voegen
Mobiele fase voorbeelden water of ethanol etc.
De stationaire fase is in het voorbeeld papier.
Rf=afstand afgelegde stof/afstand afgelegde door het oplosmiddel
Rx= afstand afgelegde stof/afstand afgelegd door referentie
(referentie is een bekende stof, waarvan afstand/snelheid bekend is.)
Kolom chromatografie:
Een probleem bij kolom chromatografie is diffusie, waardoor de scheiding minder wordt.
Wanneer de snelheid hoger is, is er veel minder diffusie. Om de snelheid te verhogen zijn er
twee systemen: HPLC (high-performance liquid chromatography) en FPLC (fast protein liquid
chromatography). Deze systemen verhogen de druk d.m.v. de pomp.
,De verschillen tussen HPLC en FPLC is de hoeveelheid druk.
Bij FPLC is deze druk lager, en er worden componenten gebruikt die geen eiwit-denatuartie
veroorzaken. Vaak wordt dit dan ook gebruikt voor grote moleculen zoals eiwitten.
Bij HPLC is de druk hoger, en er worden componenten gebruikt die bestand zijn tegen druk.
Dit wordt vaak bij kleine moleculen gebruikt.
Ook bestaat er gas chromatografie, hierbij is mobiele fase gas en de stationaire fase is
vloeibaar.
Detectors
Chromatogram is de output van de chromatografie. Hierin wordt gekeken naar de pieken, de
wijdte, de hoogte en wanneer de piek plaats vindt.
De wanneer is de retentietijd: De tijd tussen injecteren van het monster en het midden van
de piek van het eluaat. Daarvan zijn nog twee varianten:
Bruto retentietijd: Tr
Netto retentietijd: T ‘r = Tr-T0
De dode tijd/volume is de tijd/volume die nodig is voor de mobiele fase om de kolom te
verlaten.
Formules:
𝑡𝑏 −𝑡0
Selectiviteit → 𝛼 = 𝑡𝑎 −𝑡0
(verschil in retentietijd)
Hoe hoger hoe beter
2(𝑡𝑎 −𝑡𝑏 )
Resolutie → R = 𝑊𝑎 + 𝑊𝑏
(verschil in tijd/verschil in wijdte)
Hoe hoger hoe beter
Schotelgetal: hoeveel pieken:
hoe hoger het schotelgetal hoe
beter de efficiëntie.
Efficiëntie kan verhoogd worden door: de lengte van kolom verlengen, kleine deeltjes,
constante doorloopsnelheid.
Analyseren hoeveel stof er is geanalyseerd kan met:
Externe standaardisatie: Vergelijken met een ijklijn.
Interne standaardisatie:
Toevoegen van referentie stof, daarna het bepalen van de respons-factor met standaarden
als laatste de verhouding van de referentie stof de concentratie van de te meten stof
bepalen.
, Gelfiltratie
Bij gelfiltratie zitten er bepaalde bolletjes
in de kolom die poriën bevatten. Hierdoor
nemen de eiwitten die klein genoeg zijn
om door de poriën heen te gaan een
omweg en komen de eiwitten die groter
zijn eerder naar beneden dan de kleine
eiwitten.
Het molmassa kan berekend worden met
gelfiltratie. Voorbeeld:
Les 2 Affiniteitschromatografie en scheiding op basis van polariteit
Eiwitten
Eiwitten zijn opgebouwd uit aminozuren. Een aminozuur bestaat altijd uit een centrale alfa
carbon met daaraan een aminogroep, carboxylgroep en een restgroep. Er bestaat hydrofobe
(apolair) en hydrofiele (polair) aminozuren, deze eigenschap wordt bepaalt door de
restgroep. Zure en basische aminozuren hebben een lading.
Chromatografie wordt gebruikt om aparte bestanddelen te scheiden. Het principe hiervan is:
De scheiding van componenten op basis van affiniteit voor 2 fasen die niet mengbaar zijn.
Elk systeem bevat de volgende basiscomponenten:
- Stationaire fase: Een stilstaande fase: dit kan zowel vast als vloeibaar zijn.
- Chromatografisch bed: Waar de stationaire fase zich in bevindt (vaak een
glazen of metalen kolom)
- Mobiele fase: De bewegende fase: dit kan zowel vloeibaar als gas zijn.
- Delivery system: Het systeem dat ervoor zorgt dat de mobiele fase door
de stationaire fase gaat.
Voor chromatografische systemen geldt dat stoffen met een hoge affiniteit voor
de stationaire fase vertraagd worden in de kolom.
Er bestaan twee soorten van chromatografie:
Preparatief, hierbij is al bekend wat wordt gescheiden & analytisch, hierbij zijn
de te scheiden producten onbekend.
De scheidingsprincipes zijn: gelfiltratie, affiniteit, adsorptie, partitie of ion-uitwisseling.
Dunne laag chromatografie:
Hierbij wordt er een dunne laag van een absorberend materiaal in een klein laagje
oplosmiddel gehouden. Door aan de dunne laag te onderzoeken stoffen toe te voegen
Mobiele fase voorbeelden water of ethanol etc.
De stationaire fase is in het voorbeeld papier.
Rf=afstand afgelegde stof/afstand afgelegde door het oplosmiddel
Rx= afstand afgelegde stof/afstand afgelegd door referentie
(referentie is een bekende stof, waarvan afstand/snelheid bekend is.)
Kolom chromatografie:
Een probleem bij kolom chromatografie is diffusie, waardoor de scheiding minder wordt.
Wanneer de snelheid hoger is, is er veel minder diffusie. Om de snelheid te verhogen zijn er
twee systemen: HPLC (high-performance liquid chromatography) en FPLC (fast protein liquid
chromatography). Deze systemen verhogen de druk d.m.v. de pomp.
,De verschillen tussen HPLC en FPLC is de hoeveelheid druk.
Bij FPLC is deze druk lager, en er worden componenten gebruikt die geen eiwit-denatuartie
veroorzaken. Vaak wordt dit dan ook gebruikt voor grote moleculen zoals eiwitten.
Bij HPLC is de druk hoger, en er worden componenten gebruikt die bestand zijn tegen druk.
Dit wordt vaak bij kleine moleculen gebruikt.
Ook bestaat er gas chromatografie, hierbij is mobiele fase gas en de stationaire fase is
vloeibaar.
Detectors
Chromatogram is de output van de chromatografie. Hierin wordt gekeken naar de pieken, de
wijdte, de hoogte en wanneer de piek plaats vindt.
De wanneer is de retentietijd: De tijd tussen injecteren van het monster en het midden van
de piek van het eluaat. Daarvan zijn nog twee varianten:
Bruto retentietijd: Tr
Netto retentietijd: T ‘r = Tr-T0
De dode tijd/volume is de tijd/volume die nodig is voor de mobiele fase om de kolom te
verlaten.
Formules:
𝑡𝑏 −𝑡0
Selectiviteit → 𝛼 = 𝑡𝑎 −𝑡0
(verschil in retentietijd)
Hoe hoger hoe beter
2(𝑡𝑎 −𝑡𝑏 )
Resolutie → R = 𝑊𝑎 + 𝑊𝑏
(verschil in tijd/verschil in wijdte)
Hoe hoger hoe beter
Schotelgetal: hoeveel pieken:
hoe hoger het schotelgetal hoe
beter de efficiëntie.
Efficiëntie kan verhoogd worden door: de lengte van kolom verlengen, kleine deeltjes,
constante doorloopsnelheid.
Analyseren hoeveel stof er is geanalyseerd kan met:
Externe standaardisatie: Vergelijken met een ijklijn.
Interne standaardisatie:
Toevoegen van referentie stof, daarna het bepalen van de respons-factor met standaarden
als laatste de verhouding van de referentie stof de concentratie van de te meten stof
bepalen.
, Gelfiltratie
Bij gelfiltratie zitten er bepaalde bolletjes
in de kolom die poriën bevatten. Hierdoor
nemen de eiwitten die klein genoeg zijn
om door de poriën heen te gaan een
omweg en komen de eiwitten die groter
zijn eerder naar beneden dan de kleine
eiwitten.
Het molmassa kan berekend worden met
gelfiltratie. Voorbeeld:
Les 2 Affiniteitschromatografie en scheiding op basis van polariteit
Eiwitten
Eiwitten zijn opgebouwd uit aminozuren. Een aminozuur bestaat altijd uit een centrale alfa
carbon met daaraan een aminogroep, carboxylgroep en een restgroep. Er bestaat hydrofobe
(apolair) en hydrofiele (polair) aminozuren, deze eigenschap wordt bepaalt door de
restgroep. Zure en basische aminozuren hebben een lading.
