Practicum 1: Eiwitten
Door Rosa Wassenaar (6093345, groep 9) en Michelle Weesie (6157904, groep 10).
Samenvatting
In het practicum zijn de eigenschappen van eiwit x en eiwit y onderzocht. Uit de resultaten van
de SDS-PAGE en de Western Blot bleek dat eiwit y uit 5 subunits van 50 kDa bestaat, die met
elkaar zijn verbonden via zwavelbruggen. Het molecuulgewicht van eiwit x is bepaald uit SDS-
PAGE en aan de hand van de gelopen afstand van markereiwitten. Het molecuulgewicht van eiwit
x is 70 kDa.
Ook is de eiwitconcentratie van een kalfsserum bepaald. De eiwitconcentratie van het 1:100
verdunde serum was 0,113 g/ml. Met deze informatie is de concentratie van het niet-verdunde
serum berekend. Hieruit volgde een concentratie van 11,3 g/ml. Door een fout in de
verdunningsreeks is deze waarde waarschijnlijk incorrect.
Inleiding
SDS-PAGE en Western Blot zijn twee technieken waarmee de eigenschappen van een eiwit
kunnen worden onderzocht. SDS-PAGE maakt gebruik van een zeep, SDS, die non-covalent
bindt aan eiwitten, waardoor ze negatief geladen worden. Ook worden eiwitten gedenatureerd
door SDS, waardoor ze uitvouwen. In een acrylamide-gel worden de eiwitten geladen en er wordt
een spanning aangelegd, waardoor eiwitten van de kathode (-) naar de anode (+) migreren.
Grotere eiwitten blijven hoog in de gel hangen, terwijl de kleinere verder naar de positieve pool
migreren. Eiwitten in een mengsel worden gescheiden op basis van grootte.
De resultaten van SDS-PAGE worden door elektroforese overgebracht op een membraan, waar
een antilichaam op is aangebracht tegen een specifiek eiwit. Aan het antilichaam is een
fluorescente groep gekoppeld, waardoor het eiwit van interesse uit het celextract op het
membraan gedetecteerd kan worden. Er wordt informatie verkregen over verschillende
eigenschappen van de eiwitten, zoals: wat is het molecuulgewicht van het eiwit van interesse?
Wanneer eiwitten in een reducerend milieu worden gebracht, worden eventuele covalente
zwavelbruggen tussen subunits of tussen andere eiwitten verbroken. Dit kan worden gezien in de
resultaten van de SDS-PAGE en Western Blot. Zo kunnen de volgende vragen beantwoord
worden: zijn er sub-units in het eiwitcomplex aanwezig die aan elkaar verbonden zijn via
zwavelbruggen? En hoe ziet de structuur van het eiwit(complex) eruit?
Een andere techniek die gebruikt wordt in onderzoek naar concentraties van eiwitten, is
spectrofotometrie. Hierbij wordt gemeten in hoeverre licht van een bepaalde golflengte door een
opgeloste stof wordt geabsorbeerd. De concentratie van een oplossing wordt bepaald uit de mate
van de absorptie van licht. Er wordt gekozen voor een golflengte waarbij de stof van interesse
een grote absorptie vertoont en de andere stoffen in de oplossing een zo klein mogelijke. De wet
van Lambert-Beer kan gebruikt worden bij het beantwoorden van de vraag: wat is de
eiwitconcentratie van het te onderzoeken serum in een verdunde en onverdunde toestand?
, Resultaten
De verdunningsreeks van het kalverserum is op deze manier gemaakt:
1. Verdunning 1:100: 50 microliter + 4950 microliter FZ
2. Verdunning 1:400: 0,5 milliliter van stap 1 + 1,5 milliliter FZ
3. Verdunning 1:1200: 0,5 milliliter van stap 2 + 1,0 milliliter FZ
Experiment 1: SDS-polyacrylamide en Western Blot
● Eiwitbandenpatroon
M x yr ynr
Figuur 1: Bandenpatroon van eiwit x en y t.o.v. markereiwitten. Hieruit wordt het molecuulgewicht
van eiwit x bepaald.
Door Rosa Wassenaar (6093345, groep 9) en Michelle Weesie (6157904, groep 10).
Samenvatting
In het practicum zijn de eigenschappen van eiwit x en eiwit y onderzocht. Uit de resultaten van
de SDS-PAGE en de Western Blot bleek dat eiwit y uit 5 subunits van 50 kDa bestaat, die met
elkaar zijn verbonden via zwavelbruggen. Het molecuulgewicht van eiwit x is bepaald uit SDS-
PAGE en aan de hand van de gelopen afstand van markereiwitten. Het molecuulgewicht van eiwit
x is 70 kDa.
Ook is de eiwitconcentratie van een kalfsserum bepaald. De eiwitconcentratie van het 1:100
verdunde serum was 0,113 g/ml. Met deze informatie is de concentratie van het niet-verdunde
serum berekend. Hieruit volgde een concentratie van 11,3 g/ml. Door een fout in de
verdunningsreeks is deze waarde waarschijnlijk incorrect.
Inleiding
SDS-PAGE en Western Blot zijn twee technieken waarmee de eigenschappen van een eiwit
kunnen worden onderzocht. SDS-PAGE maakt gebruik van een zeep, SDS, die non-covalent
bindt aan eiwitten, waardoor ze negatief geladen worden. Ook worden eiwitten gedenatureerd
door SDS, waardoor ze uitvouwen. In een acrylamide-gel worden de eiwitten geladen en er wordt
een spanning aangelegd, waardoor eiwitten van de kathode (-) naar de anode (+) migreren.
Grotere eiwitten blijven hoog in de gel hangen, terwijl de kleinere verder naar de positieve pool
migreren. Eiwitten in een mengsel worden gescheiden op basis van grootte.
De resultaten van SDS-PAGE worden door elektroforese overgebracht op een membraan, waar
een antilichaam op is aangebracht tegen een specifiek eiwit. Aan het antilichaam is een
fluorescente groep gekoppeld, waardoor het eiwit van interesse uit het celextract op het
membraan gedetecteerd kan worden. Er wordt informatie verkregen over verschillende
eigenschappen van de eiwitten, zoals: wat is het molecuulgewicht van het eiwit van interesse?
Wanneer eiwitten in een reducerend milieu worden gebracht, worden eventuele covalente
zwavelbruggen tussen subunits of tussen andere eiwitten verbroken. Dit kan worden gezien in de
resultaten van de SDS-PAGE en Western Blot. Zo kunnen de volgende vragen beantwoord
worden: zijn er sub-units in het eiwitcomplex aanwezig die aan elkaar verbonden zijn via
zwavelbruggen? En hoe ziet de structuur van het eiwit(complex) eruit?
Een andere techniek die gebruikt wordt in onderzoek naar concentraties van eiwitten, is
spectrofotometrie. Hierbij wordt gemeten in hoeverre licht van een bepaalde golflengte door een
opgeloste stof wordt geabsorbeerd. De concentratie van een oplossing wordt bepaald uit de mate
van de absorptie van licht. Er wordt gekozen voor een golflengte waarbij de stof van interesse
een grote absorptie vertoont en de andere stoffen in de oplossing een zo klein mogelijke. De wet
van Lambert-Beer kan gebruikt worden bij het beantwoorden van de vraag: wat is de
eiwitconcentratie van het te onderzoeken serum in een verdunde en onverdunde toestand?
, Resultaten
De verdunningsreeks van het kalverserum is op deze manier gemaakt:
1. Verdunning 1:100: 50 microliter + 4950 microliter FZ
2. Verdunning 1:400: 0,5 milliliter van stap 1 + 1,5 milliliter FZ
3. Verdunning 1:1200: 0,5 milliliter van stap 2 + 1,0 milliliter FZ
Experiment 1: SDS-polyacrylamide en Western Blot
● Eiwitbandenpatroon
M x yr ynr
Figuur 1: Bandenpatroon van eiwit x en y t.o.v. markereiwitten. Hieruit wordt het molecuulgewicht
van eiwit x bepaald.
