BV05MBT samenvatting

Samenvatting MBT

, Sarnen vatting MBT




PCR stappen :



Jenaturatie : ( by ca .
95°C )
De DNA template women
-




DNA
2
Strengen Van net Los


Annealing :( by Ca so -
65°C )

afhanuelyu
-




Annealing temperature Van de primers
-



In deice stop binder de primers aan het DNA .




Ex tense / Elongate :C 72°C )
by
Polymerase
-




de primers maauteo het
uerlengt en een DNA sequentle complemental r aan




template DNA .




DNA Replicate in de cel :




door diverse Zoals Helicase
DNA
gerepliceerd
°

wordt in vivo enzymes : .




Primase en
Polymerase .




De DNA Replicate Vindt
op de leading lagging strand
°

plaats en

' '
°
De 5 3
een
verloopt van naar en


de ander d. m.ir .
Ouaeaui
fragment en




Richt Van Replicate
ing
:



DNA door
aangemaaht
°
wordt


polymerase .
dit
enzym beweegt
het
'

over DNA van 3 naar 5 ,
Maar



synthetiseerd 3:
'


Van 5 naar




Verschillen Replicate ( Vitro ) Vs PCR ( vitro ) :




Replicate PCR
°
RNA primers °
Artifkléle DNA
primers
Helicase ( 's )
Oligo
0




°
37°C + Pola °

gboc
Pol
72°C met
tag
°

, PCR
Program ma :




stop 0 Denaturatie
96°C 5- 10min


Stop 1 Denaturation
96°C 15s -

30s

Strap -65°C her halen
2
Annealing 50 15s 30s 30 40 beer
-
-




strap 3 Ex tense 72 °C 30s
-

5min

Stop DNA 72°C 10min
4
syntheses


Annealing ( Hybridisation primer ) :




By -65°C de
annealing temp ( Ta ) afhanuelyu de
°

Ca ideate Van
. 50 .
waarby is


smelt temperature
0
De smelt temperature wordt bereuend door voor alle A ent ,
2°C te teller

en voor eine Gen C . 4°C
°
Om TA te Fwd Tm
de
juste nemen ,
wordt voor RU en primer de bereuend ,
herby
wordt 5°C Tm TA
Laagste gehaald
→
er Van de Dit wordt
je


eleutroforese
Analyse via
Agarose gel :




By eleutroforese wordt het DNA
gescheden op basis Van Grootte
°


agarose gel
een .




hanalen Porién Waardoor het DNA
Ago han
°
3- dimension ace structuur
gel een
rose is met en



grater het Template DNA des te langzamer
Hoe het door die
migreren ☐ .
us
porién en hanalen


gaat .




primer Design :


°
Primers
Zyn Oligonucleotide Complement air n .
aan de 3
'

uiteinde Van
je Template .
De 2
primers ,




Forward ( Fwd ) en Reversed CRVS) net de dubbele
Streng
,
zijn start punt voor
polymerase om


te
syntnetiseren .




°
Om een stun template te
vermenigvuldigen Zyn er
template speafieue primers nodig ,
deee

hand Primer
On twerp
je aan de Van de
design regeis :
*
Primer nucleotiden
lengte van 17 28
-




AT 's
Percentage GC 's
*
Gc tussen 60% template
40 redelyugelyuverdeeld over
-




,
en


*
'


3 end Van de met G of C
primer eindigd
* Zeit annealing
Voor nom →
complementare sequentles
* ( Tm )
Smelttemperatuur -65°C 5°C
tussen so .
primers mogen niet meerdan cut eluaar
tigger .

, Sarnen
vatting kloneren WC 3




Waaromkloneren ?
°
hloneren het DNA daar het te doer :
is manipuleren van on
volgende mee

*
Eiwit hoeueelheden produceren ( coals insulin e)
in
grote
*
Function van of onderzoeuen
genen
☐ omeinen van
genen
*
Effect van mutant en bestuderen
gen
( GFP fluorescent remanent
*
Ondereoeuen wanneer een promoter actief is




kloneer stappen :




Digest
0
ie :




DNA Cplasmide of template) met Restrict ie (RE ) hnippen Restriction enzymen
-




enzymen .




Verbreuen de Suther fosfaat teeter RE hebben does
eigenlyu defunct ie om DNA
-


,




te Knipper op speafieue sequentles en
vervolgends te lineariseren .




RE (Reversed complementair )
-




hnippen op palingdromen


Knip warranties :

RE 's
zijn te under Variates
•
in 2 :



-




sticky end / Bland
-


ends
⑥pµgµ/pµ@
Type Restrict ie
enzymen
:




°
lsoschizomeren Heruennen dezelfde
:

sequentIes
( Restrict ie sites)

Neoschizomeren : Herhennendeeelfde Anders
sequentles Maar unippen
0

,




Isocaudomeren Herhennen dezelfde
sequent es
°
:
Verschillende / ,
Maar
geuen
Sticky -
ends




Digest /e :



lean met 1 of 2
Digest ie
°
restrict ie
enzymen Worden
uitgeuoerd
Digest /e met 1 RE : Uan
Lyden tot zeif
ligate uan de plasmide of het insert is
°




Verwoerd de
in plasmid geligeerd .




Digest RE
Geeftgeen Zelf ligate
°
met 2 insert lean op 1
:
ie en Maar manier