Samenvatting REC - Recombinant DNA
Basis van kloneren
Kloneren kan voor verschillende toepassingen worden gebruikt:
- Medisch
• Productie van hormonen, vaccinatie, antilichamen, medicijnen
- Industrial
• Ethylene oxide (plastics), alcohol
- Environmental
• GGO degradation of wastes,
- Agriculture
• N2 fixing bacteria, resistant to plants
- Research
• Functional analysis of genes: knockout, mutation, expression (GFP: to track protein pr
oducts)
Kloneren gebeurt in 5 stappen:
1. Extractie: stukje DNA selecteren (insert)
2. Digestie: DNA en vector open knippen
3. Ligatie: Stukje DNA in vector ligeren
4. Transformatie: Vector in een gastcel plaatsen
5. Identificeren om zeker te weten of de transformatie is gelukt. Daarna isoleren om te kweken
De digestie vindt plaats met restrictie-enzymen. Deze moeten altijd in een buffer. ATP is nodig als c-
factor voor de ligase. Deze zit in de buffer. Het is handig om meer insert van vector toe te voegen. De
ratio vector:insert is meestal 1:3
[ng of vector : size of vector (kb)] x [size of insert (kb)] x ratio insert = hoeveelheid insert
Conjugatie is de directe overdracht van DNA tussen cellen. Transfectie is hetzelfde als transformatie,
maar dan met dierlijke cellen.
Artificeren is het competent maken van cellen. Als de cellen goed competent zijn kunnen er
ongeveer 108 kolonies per ug plasmide groeien.
Cellen kunnen op twee manieren competent gemaakt worden:
1. Chemisch: CaCl2 en heat shock (0 C → 42 C)
Bacteriemembraan is permeabel voor chloride ionen, maar niet voor calcium ionen.
De cel zal water opnemen uit lading verschil, waardoor de cel opzwelt. De heat shock
zorgt ervoor dat de bacterie schrikt en stoffen opneemt uit zijn omgeving.
Efficientie: ~106- 109 transformants/µg DNA
Bayer's junctions: structuren die het buitenste membraan verbindt met het binnense
membraan
, 2. Electroforatie: elektrische shock
De elektrische shock zorgt ervoor dat het membraan permeabel wordt, waardoor
DNA door de poriën heen kan.
Efficientie: 109-1010 tf/µg DNA
Een plasmide is rond. Hij ligt niet als een ronde cirkel in je epje, maar opgerold en opgevouwen. Dit is
niet het geval bij alle plasmides, want sommige zijn wel netjes uitgelegd. De ongeknipte plasmides in
een epje hebben dus andere vormen en dus andere snelheden waarmee ze door de gel migreren.
Hierdoor kun je meerdere bandjes op een gel krijgen, terwijl je eenzelfde groep ongeknipte plasmides
hebt gebruikt.
Wanneer je een product in een vector gaat kloneren dat geknipt is met 2 restrictie-enzymen, is er
maar 1 oriëntatie mogelijk. Is er geknipt met 1 restrictie-enzym, dan zijn er 2 oriëntaties mogelijk.
Als je een vector hebt met een blunt end en een insert met sticky end, kun je de insert blunt maken
met DNA polymerase. Hierbij kan het sticky end opgevuld (DNA polymerase) of afgebroken (Klenow
fragment) worden.
Om ervoor te zorgen dat tijdens het ligeren de vector sluit, worden fosfatases gebruikt. Dit wordt
aangedaan als er geknipt wordt met 1 restrictie-enzym, of als de uiteinden van meerdere restrictie-
enzymen op elkaar passen.
DNA polymerase heeft 3 enzymatische activiteiten:
1. 5' -> 3' polymerase activiteit
2. 3' -> 5' exonuclease activiteit
• PROOF-READING
3. 5' -> 3' exonuclease activiteit
Het Klenow fragment van DNA polymerase heeft een 3' -> 5' exonuclease activiteit en wordt veel
gebruikt bij moleculaire biologie.
,T4 DNA polymerase lijkt erg op het Klenow fragment en wordt voor 2 enzymatische activiteiten
gebruikt:
1. 5' -> 3' DNA polymerase
2. 3' -> 5' exonuclease
De 3' -> 5' exonuclease activiteit van T4 DNA polymerase is 200 keer zo groot als die van het Klenow
fragment. Daarom hebben onderzoekers de voorkeur voor T4 DNA polymerase voor het blunt maken
van een 3’ overhang.
Het lac operon zit standaard in een bacterie. Het LacI gen maakt een transcript (mRNA) dat codeert
voor een repressor. Deze kan binden aan de operator. Als de repressor op de operator gaat zitten,
wordt er geen product meer afgeschreven.
- Weinig lactose: Lac1 scheidt repressor uit. Deze gaat op de operator zitten. Omdat deze
geblokkeerd is, worden de genen die hierna komen niet meer afgeschreven.
- Veel lactose: Lac1 produceert een niet-volledige repressor. Deze passen niet op de operator,
waardoor de genen na de operator wel worden afgeschreven. De lactose wordt afgebroken.
Het lac-operon wordt gebruikt voor twee toepassingen:
1. Blauw-wit screening (IPTG/X-Gal)
2. Inductie met IPTG
, Blauw-wit screening en PCR
Blauw-wit screening: Als het lac-z operon actief is, kan hij X-gal omzetten naar een blauwe kleurstof.
Je ziet dan blauwe kolonies op de plaat. Als het lac-z operon niet actief is (door bijvoorbeeld een gen
dat erin gekloneerd is), kan hij de X-gal niet meer omzetten. Hierdoor zie je alleen witte kolonies op
de plaat. Met dit mechanisme kun je eenvoudig screenen op recombinanten of mutaties.
Vector is geschikt voor blauw-wit screening:
lacZΔM15
IPTG zorgt voor positieve inductie van B-galactosidase. B-galactosidase zorgt ervoor dat X-gal omgezet
kan worden. Indien er geen B-galactosidase geproduceerd wordt (bijv. door inactivatie of na een
klonering), kan X-gal niet omgezet worden.
Als een gastheer een defect B-galactosidase gen heeft, kan het zijn dat de plasmide in de gastheer het
ontbrekende stuk bevat, waardoor het B-galacosidase gen toch een functioneel enzym kan
afschrijven complementatie (ze vullen elkaar aan). Indien er een klonatie uitgevoerd wordt, kan
het zijn dat de nieuwe vector deze balans verstoord.
Onder normale omstandigheden is B-galactosidase amper aanwezig. Na toevoeging van melk (lactose)
zorgt het Lac operon ervoor dat er een 1000voudige toename van B-galactosidase plaatsvindt, binnen
15 minuten. IPTG en allogon hebben hetzelfde effect als lactose.
Het Lac operon bestaat uit een aantal stukjes:
- Lac Z: B-galactosidase
- Lac Y: permease
- Lac A: Transacetylase
- Lac I: maakt een transcript (mRNA) dat codeert voor een repressor
Plasmides
De bekendste vectoren zijn de plasmiden. Deze komen van nature voor in bacteriën. Hier zijn het
vaak dragers van antibiotica resistentie. Een plasmide is een circulair stukje DNA dat zichzelf kan
vermenigvuldigen dmv replicatie. Hiervoor heeft hij een origin of replication (ORI). Plasmiden
variëren in grootte van 1-500 Kb. In een cel kunnen meerdere kopieën liggen. Op basis van het aantal
kopieën worden ze ingedeeld in low, medium en high copy number plasmiden.
In een bacterie kunnen dus twee stukken DNA liggen: het chromosomale DNA en het plasmide DNA
(extra-chromosomaal DNA). In het algemeen zal er na een celdeling weer opnieuw apart
chromosomaal en extra-chromosomaal DNA gevormd worden. Af en toe vindt er recombinatie plaats:
het plasmide integreert in het chromosomaal DNA. Dit geïntegreerde DNA noemen we een episoom.
Een polylinker is een gebied op het chromosomale DNA waar een plasmide in kan worden gezet.
Er zijn verschillende vectorsystemen die verschillende hoeveelheden DNA kunnen opnemen:
1. Plasmide vectoren
Plasmide vectoren zijn dubbelstrengs, circulair, kunnen zichzelf repliceren en zijn extra-
chromosomaal. Ze bevatten een multiple cloning site (MCS): stuk DNA dat door meerdere
enzymen (dicht op elkaar) geknipt kan worden
Voordelen: klein dus makkelijk te bewerken, eenvoudige selectie strategiën, handig voor
inserts <10 Kb
Nadelen: niet te gebruiken voor insert >10 Kb
Basis van kloneren
Kloneren kan voor verschillende toepassingen worden gebruikt:
- Medisch
• Productie van hormonen, vaccinatie, antilichamen, medicijnen
- Industrial
• Ethylene oxide (plastics), alcohol
- Environmental
• GGO degradation of wastes,
- Agriculture
• N2 fixing bacteria, resistant to plants
- Research
• Functional analysis of genes: knockout, mutation, expression (GFP: to track protein pr
oducts)
Kloneren gebeurt in 5 stappen:
1. Extractie: stukje DNA selecteren (insert)
2. Digestie: DNA en vector open knippen
3. Ligatie: Stukje DNA in vector ligeren
4. Transformatie: Vector in een gastcel plaatsen
5. Identificeren om zeker te weten of de transformatie is gelukt. Daarna isoleren om te kweken
De digestie vindt plaats met restrictie-enzymen. Deze moeten altijd in een buffer. ATP is nodig als c-
factor voor de ligase. Deze zit in de buffer. Het is handig om meer insert van vector toe te voegen. De
ratio vector:insert is meestal 1:3
[ng of vector : size of vector (kb)] x [size of insert (kb)] x ratio insert = hoeveelheid insert
Conjugatie is de directe overdracht van DNA tussen cellen. Transfectie is hetzelfde als transformatie,
maar dan met dierlijke cellen.
Artificeren is het competent maken van cellen. Als de cellen goed competent zijn kunnen er
ongeveer 108 kolonies per ug plasmide groeien.
Cellen kunnen op twee manieren competent gemaakt worden:
1. Chemisch: CaCl2 en heat shock (0 C → 42 C)
Bacteriemembraan is permeabel voor chloride ionen, maar niet voor calcium ionen.
De cel zal water opnemen uit lading verschil, waardoor de cel opzwelt. De heat shock
zorgt ervoor dat de bacterie schrikt en stoffen opneemt uit zijn omgeving.
Efficientie: ~106- 109 transformants/µg DNA
Bayer's junctions: structuren die het buitenste membraan verbindt met het binnense
membraan
, 2. Electroforatie: elektrische shock
De elektrische shock zorgt ervoor dat het membraan permeabel wordt, waardoor
DNA door de poriën heen kan.
Efficientie: 109-1010 tf/µg DNA
Een plasmide is rond. Hij ligt niet als een ronde cirkel in je epje, maar opgerold en opgevouwen. Dit is
niet het geval bij alle plasmides, want sommige zijn wel netjes uitgelegd. De ongeknipte plasmides in
een epje hebben dus andere vormen en dus andere snelheden waarmee ze door de gel migreren.
Hierdoor kun je meerdere bandjes op een gel krijgen, terwijl je eenzelfde groep ongeknipte plasmides
hebt gebruikt.
Wanneer je een product in een vector gaat kloneren dat geknipt is met 2 restrictie-enzymen, is er
maar 1 oriëntatie mogelijk. Is er geknipt met 1 restrictie-enzym, dan zijn er 2 oriëntaties mogelijk.
Als je een vector hebt met een blunt end en een insert met sticky end, kun je de insert blunt maken
met DNA polymerase. Hierbij kan het sticky end opgevuld (DNA polymerase) of afgebroken (Klenow
fragment) worden.
Om ervoor te zorgen dat tijdens het ligeren de vector sluit, worden fosfatases gebruikt. Dit wordt
aangedaan als er geknipt wordt met 1 restrictie-enzym, of als de uiteinden van meerdere restrictie-
enzymen op elkaar passen.
DNA polymerase heeft 3 enzymatische activiteiten:
1. 5' -> 3' polymerase activiteit
2. 3' -> 5' exonuclease activiteit
• PROOF-READING
3. 5' -> 3' exonuclease activiteit
Het Klenow fragment van DNA polymerase heeft een 3' -> 5' exonuclease activiteit en wordt veel
gebruikt bij moleculaire biologie.
,T4 DNA polymerase lijkt erg op het Klenow fragment en wordt voor 2 enzymatische activiteiten
gebruikt:
1. 5' -> 3' DNA polymerase
2. 3' -> 5' exonuclease
De 3' -> 5' exonuclease activiteit van T4 DNA polymerase is 200 keer zo groot als die van het Klenow
fragment. Daarom hebben onderzoekers de voorkeur voor T4 DNA polymerase voor het blunt maken
van een 3’ overhang.
Het lac operon zit standaard in een bacterie. Het LacI gen maakt een transcript (mRNA) dat codeert
voor een repressor. Deze kan binden aan de operator. Als de repressor op de operator gaat zitten,
wordt er geen product meer afgeschreven.
- Weinig lactose: Lac1 scheidt repressor uit. Deze gaat op de operator zitten. Omdat deze
geblokkeerd is, worden de genen die hierna komen niet meer afgeschreven.
- Veel lactose: Lac1 produceert een niet-volledige repressor. Deze passen niet op de operator,
waardoor de genen na de operator wel worden afgeschreven. De lactose wordt afgebroken.
Het lac-operon wordt gebruikt voor twee toepassingen:
1. Blauw-wit screening (IPTG/X-Gal)
2. Inductie met IPTG
, Blauw-wit screening en PCR
Blauw-wit screening: Als het lac-z operon actief is, kan hij X-gal omzetten naar een blauwe kleurstof.
Je ziet dan blauwe kolonies op de plaat. Als het lac-z operon niet actief is (door bijvoorbeeld een gen
dat erin gekloneerd is), kan hij de X-gal niet meer omzetten. Hierdoor zie je alleen witte kolonies op
de plaat. Met dit mechanisme kun je eenvoudig screenen op recombinanten of mutaties.
Vector is geschikt voor blauw-wit screening:
lacZΔM15
IPTG zorgt voor positieve inductie van B-galactosidase. B-galactosidase zorgt ervoor dat X-gal omgezet
kan worden. Indien er geen B-galactosidase geproduceerd wordt (bijv. door inactivatie of na een
klonering), kan X-gal niet omgezet worden.
Als een gastheer een defect B-galactosidase gen heeft, kan het zijn dat de plasmide in de gastheer het
ontbrekende stuk bevat, waardoor het B-galacosidase gen toch een functioneel enzym kan
afschrijven complementatie (ze vullen elkaar aan). Indien er een klonatie uitgevoerd wordt, kan
het zijn dat de nieuwe vector deze balans verstoord.
Onder normale omstandigheden is B-galactosidase amper aanwezig. Na toevoeging van melk (lactose)
zorgt het Lac operon ervoor dat er een 1000voudige toename van B-galactosidase plaatsvindt, binnen
15 minuten. IPTG en allogon hebben hetzelfde effect als lactose.
Het Lac operon bestaat uit een aantal stukjes:
- Lac Z: B-galactosidase
- Lac Y: permease
- Lac A: Transacetylase
- Lac I: maakt een transcript (mRNA) dat codeert voor een repressor
Plasmides
De bekendste vectoren zijn de plasmiden. Deze komen van nature voor in bacteriën. Hier zijn het
vaak dragers van antibiotica resistentie. Een plasmide is een circulair stukje DNA dat zichzelf kan
vermenigvuldigen dmv replicatie. Hiervoor heeft hij een origin of replication (ORI). Plasmiden
variëren in grootte van 1-500 Kb. In een cel kunnen meerdere kopieën liggen. Op basis van het aantal
kopieën worden ze ingedeeld in low, medium en high copy number plasmiden.
In een bacterie kunnen dus twee stukken DNA liggen: het chromosomale DNA en het plasmide DNA
(extra-chromosomaal DNA). In het algemeen zal er na een celdeling weer opnieuw apart
chromosomaal en extra-chromosomaal DNA gevormd worden. Af en toe vindt er recombinatie plaats:
het plasmide integreert in het chromosomaal DNA. Dit geïntegreerde DNA noemen we een episoom.
Een polylinker is een gebied op het chromosomale DNA waar een plasmide in kan worden gezet.
Er zijn verschillende vectorsystemen die verschillende hoeveelheden DNA kunnen opnemen:
1. Plasmide vectoren
Plasmide vectoren zijn dubbelstrengs, circulair, kunnen zichzelf repliceren en zijn extra-
chromosomaal. Ze bevatten een multiple cloning site (MCS): stuk DNA dat door meerdere
enzymen (dicht op elkaar) geknipt kan worden
Voordelen: klein dus makkelijk te bewerken, eenvoudige selectie strategiën, handig voor
inserts <10 Kb
Nadelen: niet te gebruiken voor insert >10 Kb
