HPLC Samenvatting - HPLC1

HPLC1 Samenvatting

Les 1

HPLC

- Hoge prestatie vloeistofchromatografie  vroeger: hoge druk vloeistofchromatografie
- Buis met pakking  stationaire fase
o Pakking bestaat uit silica
 Niet-gemodificeerde silica = polair  Normal-HPLC (N-HPLC)
 Gemodificeerde silica = apolair  Reversed Phase-HPLC (RP-HPLC)
 Het omzetten van N-HPLC in RP-HPLC heet endcapping. Hierbij wordt
elke OH-groep omgezet in een niet-polaire groep
 Er bestaan meerdere vormen van silica
 Nadeel: bij een hoge pH zal er hydrolyse van de silicagel plaatsvinden,
waardoor het niet meer geschikt is voor HPLC
 Dit kun je zien door snelle achteruitgang in efficiëntie, meer
piekverbreding en verhoging van de druk
- Doorstromen met vloeistof  mobiele fase
o Bestaat meestal uit water, waterige bufferoplossing, water en organisch oplosmiddel
en mengsels van organische oplosmiddelen (vaak ook in gradiënt).
o Eluent moet van tevoren ontgast en gefiltreerd worden.
 Ontgassing bijv. door doorstroming met helium
 Voorkomt storingen aan de apparatuur
 Ook de pomp moet stofvrij zijn.
- Stof verdeelt zich over mobiele en stationaire fase
o De stationaire fase vertraagt verschillende componenten
- Je wilt hoge schotelgetallen krijgen (>10000), dus lage schotelhoogtes  kleine
deeltjesdiameter (dp) pakking nodig
L
o H=
N
 H = schotelhoogte
 N = schotelgetal
 L = lengte kolom
o Om vloeistof toch er doorheen te krijgen, is er hoge (pomp)druk nodig.
- Apparatuur

, - Pomp
o Debiet (flow) F
 F tussen 10 – 10000 μL/min
 Zeer constant debiet nodig in verband met detectie
o Pmax = 40 MPA
o Diverse typen pompen beschikbaar
 Twee pompen die onafhankelijk van elkaar werken  binair pompsysteem
 Nauwkeurige regeling van de twee oplosmiddelfracties
 Zeswegkraan nodig  duurder
- Injectiesysteem
o Zeswegkraan waarin een zogenaamde monsterlus is opgenomen
o Monsterkraan moet bestand zijn tegen hoge drukken en ‘dode’ ruimten moet
worden vermeden om extra piekverbreding te vermijden.
o Monster wordt hierin meteen vermengd met het oplosmiddel
- Kolom
o Eigenschappen
 Roestvast staal
 Lengte (L) 5-20 cm
 Inwendige diameter 4-5 mm
 Invloed verbinding kolom-detector op de uiteindelijke piekvorm
o De dode ruimten bij aansluitingen op de kolom moeten zo klein mogelijk zijn!
- Detector
o Tegenwoordig veelal gekoppeld aan UV-detector
 Hoge gevoeligheid
 Groot meetbereik
 Vrij ongevoelig voor temperatuursveranderingen
o Computer maakt signaal zichtbaar

Wanneer pas je welke techniek toe?

- Vluchtig monster  GC mogelijk
- Monster niet vluchtig  (HP)LC mogelijk
- Grote moleculen  GPC mogelijk

Wanneer HPLC toepassen

- Bij sterk polaire mengsels
- Hoge molecuulmassa’s
- Thermisch instabiele materialen
- Materialen met een neiging tot ionisatie

Formules  zie formuleblad

∆ t R, j , i
- Resolutie: R j ,i=
2(σ t ¿ ¿ , j−σ t ,i) ¿
L
Retentietijd: t R , i= ( 1+k i ) =t R , 0 (1+k i)
' '
-
μ

( )
2
tR
- Schotelgetal: N=
σt