Samenvatting
onderzoeksmethoden
Thema 1 - DNA, RNA & eiwitten
Biomedische Wetenschappen
2020-2021
Door Nicole (studente BMW)
,Inhoudsopgave
Pathogene micro-organismen................................................................................................................3
Bacteriën enten op platen..................................................................................................................3
Protocol..........................................................................................................................................4
Bacteriën enten in vloeibaar medium................................................................................................5
Protocol..........................................................................................................................................5
Schimmels kweken op platen.............................................................................................................5
Protocol..........................................................................................................................................5
Identificatie van micro-organismen........................................................................................................6
Gramkleuring......................................................................................................................................6
Eigenschappen................................................................................................................................6
Protocol..........................................................................................................................................7
Analyse...........................................................................................................................................9
Plasmide-isolatie.................................................................................................................................9
Protocol........................................................................................................................................14
Analyse.........................................................................................................................................16
16S rRNA analyse..............................................................................................................................17
PCR amplificatie............................................................................................................................17
Gel-elektroforese..........................................................................................................................19
BLAST sequencing.........................................................................................................................20
Antibioticaproductie door schimmels (co-cultuur)...........................................................................21
Protocol........................................................................................................................................21
Analyse.........................................................................................................................................21
Analyse van virulentiefactoren.............................................................................................................21
Fluorescentiemicroscopie.................................................................................................................21
Onderdelen...................................................................................................................................22
Katalase-assay..................................................................................................................................23
Protocol........................................................................................................................................23
Analyse.........................................................................................................................................23
Hemolyse-bepaling...........................................................................................................................23
Protocol........................................................................................................................................24
Analyse.........................................................................................................................................24
Kapseldetectie..................................................................................................................................25
Protocol........................................................................................................................................25
Analyse.........................................................................................................................................26
1
, Protease activiteit.............................................................................................................................26
Protocol........................................................................................................................................26
Analyse.........................................................................................................................................27
Antibioticaresistentie...........................................................................................................................27
ELISA.................................................................................................................................................27
Directe methode...........................................................................................................................28
Indirecte methode........................................................................................................................28
Competitieve methode.................................................................................................................28
Sandwich ELISA.............................................................................................................................28
Protocol........................................................................................................................................29
Bèta-lactamase activiteit..................................................................................................................29
Gieten van de polyacrylamide-gel (PAA-gel).................................................................................30
SDS-PAGE......................................................................................................................................31
Coomassie Blue.............................................................................................................................31
Western Blot.................................................................................................................................32
Protocol........................................................................................................................................34
Analyse.........................................................................................................................................39
Plasmideconjugatie...........................................................................................................................39
Protocol........................................................................................................................................41
Analyse.........................................................................................................................................42
MIC-assay.........................................................................................................................................42
Bouillonverdunningstest...............................................................................................................42
Epsilometertest (E-test)................................................................................................................43
Protocol........................................................................................................................................44
Analyse.........................................................................................................................................44
MBC-assay........................................................................................................................................45
Protocol........................................................................................................................................45
Analyse.........................................................................................................................................45
Rifampicine.......................................................................................................................................45
Protocol........................................................................................................................................46
Analyse.........................................................................................................................................47
2
, Pathogene micro-organismen
Pathogene micro-organismen (MO) zijn op basis van bepaalde karakteristieken in te schalen als
meer of minder gevaarlijk voor de mens. Pathogeniciteit wordt niet bepaald door één
virulentiefactor, maar door een set aan virulentiefactoren. Dit zijn stoffen die afgescheiden worden
door micro-organismen en ervoor zorgen dat het micro-organisme ziekteverwekkend wordt voor de
mens. Zo moet een humaan pathogeen in ieder geval kunnen groeien bij 37°C
(lichaamstemperatuur). Daarnaast zal het mechanismen moeten bevatten om zich te handhaven of
te verspreiden in het lichaam. Een besmetting met een micro-organisme hoeft dus niet altijd te
leiden tot een infectie. Op het moment dat er wel sprake is van een infectie, is een geschikte
behandeling van belang. Hierbij is het noodzakelijk om het soort micro-organisme eerst te
identificeren. Daarnaast is het belangrijk om het antibioticum resistentieprofiel te bekijken en
resistentieontwikkeling te voorkomen.
In grote lijnen worden er dus drie experimenten uitgevoerd, die uit deelexperimenten bestaan:
Identificatie van micro-organismen
Analyse van virulentiefactoren
Antibioticaresistentie
Voor een aantal van deze experimenten moeten de micro-organismen geënt worden:
Bacteriën enten op platen
Bacteriën enten in vloeibaar medium
Schimmels kweken op platen
Bacteriën enten op platen
Voor het enten van bacteriën op losse bouillonagar (LB) platen zijn zes platen met de verschillende
bacterieculturen nodig. Vanuit deze platen worden de bacteriën overgebracht naar nieuwe LB platen
door het maken van een entstreep of reinstrijk. Hierdoor komen de bacteriën zodanig los te liggen
van elkaar dat ze na het bebroeden uitgroeien tot losliggende koloniën in deel C van de plaat
(Figuur 1).
Figuur 1 Schematische weergave van het maken van een reinstrijk.
3
,Protocol
1. Neem een metalen entoog en haal deze door het blauwe deel van de vlam. Laat het
vervolgens 30 seconden afkoelen. Druk het entoog even kort op de binnenkant van je deksel
om te kijken of het entoog goed is afgekoeld.
Het is erg belangrijk om steriel te werken, om er zeker van te zijn dat er geen verontreiniging
van de bacteriecultuur optreedt. Steriliseer daarom je entoog vóór en ná elke stap.
Let op: Zorg dat de Bunsenbrander een blauwe vlam heeft, een oranje vlam is namelijk niet
heet genoeg om het entoog te steriliseren.
2. Neem met een steriel entoog een aantal bacteriecellen van de stockplaat.
3. Steriliseer het entoog door deze opnieuw door het blauwe deel van de vlam te halen. Laat
het wederom weer 30 seconden afkoelen.
4. Zet de cellen als een streep over op een LB-plaat (Figuur 1, stap A). Zorg ervoor dat de agar
niet beschadigt raakt, duw dus niet te hard op het entoog!
5. Steriliseer het entoog door deze opnieuw door het blauwe deel van de vlam te halen. Laat
het wederom weer 30 seconden afkoelen.
6. Draai de plaat een kwartslag. Verspreid de cellen verder van het bovenste deel van het
plaatoppervlak (Figuur 1, stap B).
Door de bacteriën steeds verder te verspreiden over de plaat, ontstaan uiteindelijk losse
cellen en zullen er losse koloniën gaan groeien op de plaat.
7. Steriliseer het entoog door deze opnieuw door het blauwe deel van de vlam te halen. Laat
het wederom weer 30 seconden afkoelen.
8. Draai de plaat een kwartslag. Verspreid de cellen verder over de rechterhelft van het
plaatoppervlak (Figuur 1, stap C).
9. Steriliseer het entoog door deze opnieuw door het blauwe deel van de vlam te halen. Als dit
de laatste reinstrijk is die gemaakt moest worden, zet dan de Bunsenbrander uit.
10. Markeer de plaat aan de onderkant met je initialen, de afgeënte bacteriestam en de datum.
Zet de plaat vervolgens in een 37°C stoof en kweek tot de volgende dag. Tips voor markeren:
Beschrijf altijd de onderkant van de plaat zodat je altijd weet welke bacteriestam hierop
groeit. De deksels kunnen namelijk gemakkelijk verwisseld worden.
Schrijf de informatie altijd langs de randen van de plaat, zodat je de bacterieculturen
altijd goed kunt bestuderen.
Plaats de platen ondersteboven in de stoof, dus met de deksel onderop. Op deze manier
kunnen er geen condensatiedruppels vanaf de deksel neervallen op de plaat.
11. Op de laatste dag van het practicum worden deze platen in de bacteriologische afvalbak
gedeponeerd. Dit is een zwarte bak met een rode deksel.
4
, Bacteriën enten in vloeibaar medium
Naast bacteriën die op platen gegroeid zijn, zijn voor bepaalde experimenten ook vloeibare cultures
nodig. Bij het enten van bacteriën op een vloeibaar medium is het belangrijk dat er per experiment
gekeken wordt, bij welke temperatuur de bacteriën gekweekt moeten worden. Hieronder volgt een
overzicht per experiment:
Tabel 1 Overzicht met de verschillende kweektemperaturen per experiment.
Experiment Temperatuur
Gramkleuring 37°C
Kapseldetectie 37°C
Plasmide-isolatie 37°C
Rifampicineresistentie 37°C
Aanwezigheid van bèta-lactamase 4°C
MIC-assay 4°C
Plasmideconjugatie 4°C
Protocol
1. Neem een 15 mL buis en breng daar op steriele wijze 5 mL vloeibaar LB medium in.
Let op: Het medium moet steriel blijven dus werk bij het vuur.
2. Vlam een entoog af om deze te steriliseren. Laat het vervolgens 30 seconden afkoelen. Druk
het entoog even kort op de binnenkant van je deksel om te kijken of het entoog goed is
afgekoeld.
Let op: Zorg dat de Bunsenbrander een blauwe vlam heeft, een oranje vlam is namelijk niet
heet genoeg om het entoog te steriliseren.
3. Gebruik dit entoog om bacteriecellen van de plaat te halen. Los de cellen op in het medium
door het entoog heen en weer te bewegen.
4. Zwenk de buis goed, zodat de cellen verdeeld raken over het vloeibare medium.
5. Markeer de buis met je initialen, de afgeënte bacteriestam en de datum.
6. Zet de buis, afhankelijk van het experiment in een stoof (37°C) of in de koelkast (4°C).
7. Na overnacht kweken zijn de cultures klaar voor gebruik.
8. Op de laatste dag van het practicum worden deze platen in de bacteriologische afvalbak
gedeponeerd. Dit is een zwarte bak met een rode deksel.
Schimmels kweken op platen
Sommige schimmels zijn in staat om antibiotica te produceren die bacteriën kunnen doden. Om te
bepalen of een schimmel antibiotica kan produceren dienen de schimmels eerst geïsoleerd te
worden.
Protocol
1. Neem een 50 mL buis en ga naar buiten. Neem hier een monster van 5 mL van interesse.
2. Vul de buis tot 40 mL aan met MiliQ en schud goed. Laat de buis 5 minuten staan.
Door de buis even te laten staan zullen de grote brokken aarde naar beneden zakken.
3. Markeer drie buizen en maak een verdunningsreeks van 10 –1, 10–2 en 10–3 supernatant.
4. Steriliseer de verdeler bij de vlam met een doekje met ethanol. Verspreid 500 µL van elke
supernatant-verdunning op een aparte potato dextrose agar (PDA) plaat. Maak de verdeler
weer schoon met een doekje met ethanol.
Ethanol is licht ontvlambaar, houd het doekje met ethanol uit veiligheidsoverwegingen
daarom 5 cm vanaf de vlam.
5. Markeer de plaat aan de onderkant met je initialen, het type monster en de datum. Zet de
plaat in een 25°C stoof en kweek het monster gedurende 7 dagen.
5
onderzoeksmethoden
Thema 1 - DNA, RNA & eiwitten
Biomedische Wetenschappen
2020-2021
Door Nicole (studente BMW)
,Inhoudsopgave
Pathogene micro-organismen................................................................................................................3
Bacteriën enten op platen..................................................................................................................3
Protocol..........................................................................................................................................4
Bacteriën enten in vloeibaar medium................................................................................................5
Protocol..........................................................................................................................................5
Schimmels kweken op platen.............................................................................................................5
Protocol..........................................................................................................................................5
Identificatie van micro-organismen........................................................................................................6
Gramkleuring......................................................................................................................................6
Eigenschappen................................................................................................................................6
Protocol..........................................................................................................................................7
Analyse...........................................................................................................................................9
Plasmide-isolatie.................................................................................................................................9
Protocol........................................................................................................................................14
Analyse.........................................................................................................................................16
16S rRNA analyse..............................................................................................................................17
PCR amplificatie............................................................................................................................17
Gel-elektroforese..........................................................................................................................19
BLAST sequencing.........................................................................................................................20
Antibioticaproductie door schimmels (co-cultuur)...........................................................................21
Protocol........................................................................................................................................21
Analyse.........................................................................................................................................21
Analyse van virulentiefactoren.............................................................................................................21
Fluorescentiemicroscopie.................................................................................................................21
Onderdelen...................................................................................................................................22
Katalase-assay..................................................................................................................................23
Protocol........................................................................................................................................23
Analyse.........................................................................................................................................23
Hemolyse-bepaling...........................................................................................................................23
Protocol........................................................................................................................................24
Analyse.........................................................................................................................................24
Kapseldetectie..................................................................................................................................25
Protocol........................................................................................................................................25
Analyse.........................................................................................................................................26
1
, Protease activiteit.............................................................................................................................26
Protocol........................................................................................................................................26
Analyse.........................................................................................................................................27
Antibioticaresistentie...........................................................................................................................27
ELISA.................................................................................................................................................27
Directe methode...........................................................................................................................28
Indirecte methode........................................................................................................................28
Competitieve methode.................................................................................................................28
Sandwich ELISA.............................................................................................................................28
Protocol........................................................................................................................................29
Bèta-lactamase activiteit..................................................................................................................29
Gieten van de polyacrylamide-gel (PAA-gel).................................................................................30
SDS-PAGE......................................................................................................................................31
Coomassie Blue.............................................................................................................................31
Western Blot.................................................................................................................................32
Protocol........................................................................................................................................34
Analyse.........................................................................................................................................39
Plasmideconjugatie...........................................................................................................................39
Protocol........................................................................................................................................41
Analyse.........................................................................................................................................42
MIC-assay.........................................................................................................................................42
Bouillonverdunningstest...............................................................................................................42
Epsilometertest (E-test)................................................................................................................43
Protocol........................................................................................................................................44
Analyse.........................................................................................................................................44
MBC-assay........................................................................................................................................45
Protocol........................................................................................................................................45
Analyse.........................................................................................................................................45
Rifampicine.......................................................................................................................................45
Protocol........................................................................................................................................46
Analyse.........................................................................................................................................47
2
, Pathogene micro-organismen
Pathogene micro-organismen (MO) zijn op basis van bepaalde karakteristieken in te schalen als
meer of minder gevaarlijk voor de mens. Pathogeniciteit wordt niet bepaald door één
virulentiefactor, maar door een set aan virulentiefactoren. Dit zijn stoffen die afgescheiden worden
door micro-organismen en ervoor zorgen dat het micro-organisme ziekteverwekkend wordt voor de
mens. Zo moet een humaan pathogeen in ieder geval kunnen groeien bij 37°C
(lichaamstemperatuur). Daarnaast zal het mechanismen moeten bevatten om zich te handhaven of
te verspreiden in het lichaam. Een besmetting met een micro-organisme hoeft dus niet altijd te
leiden tot een infectie. Op het moment dat er wel sprake is van een infectie, is een geschikte
behandeling van belang. Hierbij is het noodzakelijk om het soort micro-organisme eerst te
identificeren. Daarnaast is het belangrijk om het antibioticum resistentieprofiel te bekijken en
resistentieontwikkeling te voorkomen.
In grote lijnen worden er dus drie experimenten uitgevoerd, die uit deelexperimenten bestaan:
Identificatie van micro-organismen
Analyse van virulentiefactoren
Antibioticaresistentie
Voor een aantal van deze experimenten moeten de micro-organismen geënt worden:
Bacteriën enten op platen
Bacteriën enten in vloeibaar medium
Schimmels kweken op platen
Bacteriën enten op platen
Voor het enten van bacteriën op losse bouillonagar (LB) platen zijn zes platen met de verschillende
bacterieculturen nodig. Vanuit deze platen worden de bacteriën overgebracht naar nieuwe LB platen
door het maken van een entstreep of reinstrijk. Hierdoor komen de bacteriën zodanig los te liggen
van elkaar dat ze na het bebroeden uitgroeien tot losliggende koloniën in deel C van de plaat
(Figuur 1).
Figuur 1 Schematische weergave van het maken van een reinstrijk.
3
,Protocol
1. Neem een metalen entoog en haal deze door het blauwe deel van de vlam. Laat het
vervolgens 30 seconden afkoelen. Druk het entoog even kort op de binnenkant van je deksel
om te kijken of het entoog goed is afgekoeld.
Het is erg belangrijk om steriel te werken, om er zeker van te zijn dat er geen verontreiniging
van de bacteriecultuur optreedt. Steriliseer daarom je entoog vóór en ná elke stap.
Let op: Zorg dat de Bunsenbrander een blauwe vlam heeft, een oranje vlam is namelijk niet
heet genoeg om het entoog te steriliseren.
2. Neem met een steriel entoog een aantal bacteriecellen van de stockplaat.
3. Steriliseer het entoog door deze opnieuw door het blauwe deel van de vlam te halen. Laat
het wederom weer 30 seconden afkoelen.
4. Zet de cellen als een streep over op een LB-plaat (Figuur 1, stap A). Zorg ervoor dat de agar
niet beschadigt raakt, duw dus niet te hard op het entoog!
5. Steriliseer het entoog door deze opnieuw door het blauwe deel van de vlam te halen. Laat
het wederom weer 30 seconden afkoelen.
6. Draai de plaat een kwartslag. Verspreid de cellen verder van het bovenste deel van het
plaatoppervlak (Figuur 1, stap B).
Door de bacteriën steeds verder te verspreiden over de plaat, ontstaan uiteindelijk losse
cellen en zullen er losse koloniën gaan groeien op de plaat.
7. Steriliseer het entoog door deze opnieuw door het blauwe deel van de vlam te halen. Laat
het wederom weer 30 seconden afkoelen.
8. Draai de plaat een kwartslag. Verspreid de cellen verder over de rechterhelft van het
plaatoppervlak (Figuur 1, stap C).
9. Steriliseer het entoog door deze opnieuw door het blauwe deel van de vlam te halen. Als dit
de laatste reinstrijk is die gemaakt moest worden, zet dan de Bunsenbrander uit.
10. Markeer de plaat aan de onderkant met je initialen, de afgeënte bacteriestam en de datum.
Zet de plaat vervolgens in een 37°C stoof en kweek tot de volgende dag. Tips voor markeren:
Beschrijf altijd de onderkant van de plaat zodat je altijd weet welke bacteriestam hierop
groeit. De deksels kunnen namelijk gemakkelijk verwisseld worden.
Schrijf de informatie altijd langs de randen van de plaat, zodat je de bacterieculturen
altijd goed kunt bestuderen.
Plaats de platen ondersteboven in de stoof, dus met de deksel onderop. Op deze manier
kunnen er geen condensatiedruppels vanaf de deksel neervallen op de plaat.
11. Op de laatste dag van het practicum worden deze platen in de bacteriologische afvalbak
gedeponeerd. Dit is een zwarte bak met een rode deksel.
4
, Bacteriën enten in vloeibaar medium
Naast bacteriën die op platen gegroeid zijn, zijn voor bepaalde experimenten ook vloeibare cultures
nodig. Bij het enten van bacteriën op een vloeibaar medium is het belangrijk dat er per experiment
gekeken wordt, bij welke temperatuur de bacteriën gekweekt moeten worden. Hieronder volgt een
overzicht per experiment:
Tabel 1 Overzicht met de verschillende kweektemperaturen per experiment.
Experiment Temperatuur
Gramkleuring 37°C
Kapseldetectie 37°C
Plasmide-isolatie 37°C
Rifampicineresistentie 37°C
Aanwezigheid van bèta-lactamase 4°C
MIC-assay 4°C
Plasmideconjugatie 4°C
Protocol
1. Neem een 15 mL buis en breng daar op steriele wijze 5 mL vloeibaar LB medium in.
Let op: Het medium moet steriel blijven dus werk bij het vuur.
2. Vlam een entoog af om deze te steriliseren. Laat het vervolgens 30 seconden afkoelen. Druk
het entoog even kort op de binnenkant van je deksel om te kijken of het entoog goed is
afgekoeld.
Let op: Zorg dat de Bunsenbrander een blauwe vlam heeft, een oranje vlam is namelijk niet
heet genoeg om het entoog te steriliseren.
3. Gebruik dit entoog om bacteriecellen van de plaat te halen. Los de cellen op in het medium
door het entoog heen en weer te bewegen.
4. Zwenk de buis goed, zodat de cellen verdeeld raken over het vloeibare medium.
5. Markeer de buis met je initialen, de afgeënte bacteriestam en de datum.
6. Zet de buis, afhankelijk van het experiment in een stoof (37°C) of in de koelkast (4°C).
7. Na overnacht kweken zijn de cultures klaar voor gebruik.
8. Op de laatste dag van het practicum worden deze platen in de bacteriologische afvalbak
gedeponeerd. Dit is een zwarte bak met een rode deksel.
Schimmels kweken op platen
Sommige schimmels zijn in staat om antibiotica te produceren die bacteriën kunnen doden. Om te
bepalen of een schimmel antibiotica kan produceren dienen de schimmels eerst geïsoleerd te
worden.
Protocol
1. Neem een 50 mL buis en ga naar buiten. Neem hier een monster van 5 mL van interesse.
2. Vul de buis tot 40 mL aan met MiliQ en schud goed. Laat de buis 5 minuten staan.
Door de buis even te laten staan zullen de grote brokken aarde naar beneden zakken.
3. Markeer drie buizen en maak een verdunningsreeks van 10 –1, 10–2 en 10–3 supernatant.
4. Steriliseer de verdeler bij de vlam met een doekje met ethanol. Verspreid 500 µL van elke
supernatant-verdunning op een aparte potato dextrose agar (PDA) plaat. Maak de verdeler
weer schoon met een doekje met ethanol.
Ethanol is licht ontvlambaar, houd het doekje met ethanol uit veiligheidsoverwegingen
daarom 5 cm vanaf de vlam.
5. Markeer de plaat aan de onderkant met je initialen, het type monster en de datum. Zet de
plaat in een 25°C stoof en kweek het monster gedurende 7 dagen.
5
