Psychobiologie UvA jaar 1 - Genetica en Evolutie (5102GEEV6Y) - samenvatting deeltentamen 2

Hoofdstuk 10: Gene isolation and manipulation
PCR: om een bekende mutatie te detecteren
 TAQ Polymerase: chemotroof, doet het goed bij 70 °C en kan goed
leven tussen 50°C en 80°C
 Als de mutatie groot is (deletie/duplicatie>50bp)  PCR product op
agarose gel
 Als de mutatie klein is (SNP, insertie, deletie)  selectieve primer
- Wildtype: geen PCR product
- Mutant: wel PCR product
Dan de PCR fragmenten op een gel

DNA kleuren: gebeurt met ethydium bromide, dan UV licht

Humaan gen in een ander organisme tot expressie brengen:
 Al het mRNA uit het weefsel isoleren
 Reverse transcriptie  cDNA
 Restrictie enzymen  ligatie in vector  kloneren

Sticky ends maken:
 Speciale PCR primers met extra eind (restriction site)
 Ligeer adapters die de gewenste restriction sites bevatten aan je
cDNA (linkers)

Genexpressie onderzoeken:
 mRNA extractie
 cDNA synthese en labelen
 Op microarray plaatsen

Hoofdstuk 13: Development and evolution
Housekeeping genen: actief in alle weefsels

Weefselspecifieke genen: bepalen de aard van een weefsel

Toolbox genen:
 Actief tijdens embryonale ontwikkeling
 Groot effect
 Bilateraal effect
 Mutant heeft fenotype waarin min of meer normale lichaamsdelen op de verkeerde plek
zitten

Het probleem:
 Eicel heeft geen polariteit (anterior, posterior enz.)
 Embryo moet worden verdeeld in stukjes die een andere functie krijgen
- Ectoderm (buitenkant en zenuwstelsel)
- Mesoderm (tussenlaag)
- Endoderm (binnenkant)
 Functionele segmenten: meeste dieren, bij insecten heeft elk segment een andere functie

,Logica van patroon generatie in het vroege embryo:
 Een cascade van inducties kan het gehele embryo van een patroon voorzien
 Deze patronen genereren positionele informatie dat bepaalt wat iedere cel wordt

Maternale mRNA’s induceren polariteit in het embryo (bicoid)
Bicoid eiwit diffundeert door embryo, er ontstaat een gradiënt
Zorgt ervoor dat het embryo een voor en achterkant krijgt
Bicoid bepaalt de positie van de kop

In situ-hybridisatie: mRNA kleuren met een gelabelde probe

Immunolokalisatie: eiwit kleuren met een gelabeld antilichaam

Maternale mRNA: reguleren expressie van GAP en pair-rule genen, balen de A-P
en D-V as van het embryo
 Bicoid (transcriptie facor)
 Nanos (transcriptie repressor)
 Reguleren GAP genexpressie: 4 eiwit expressie banden
- Hunchback
- Caudal  worden later door de zygote gemaakt

De GAP eiwitten binden aan de enhancers van pair-rule genen

Pair-rule genen: 7 banden, reguleren de transcriptie van segment polarity genen
Mutanten missen delen van de segmenten

Segment-polarity genen: 14 banden, komen tot expressie in een deel van ieder
segment, bepalen het patroon van cel-differentiatie in ieder segment
Reguleren HOX genexpressie

Hox genen: bepalen wat een segment gaat doen, twee clusters op chromosoom 3, volgt A-P as
Vertebraten hebben vier cluster van HOX genen

Distalless: Dll, op verkeerde segmenten pootjes, combinatie van ultrabithorax (Ubx) en abdominal-A
(abd-A) onderdrukt Dll expressie in abdomen
Wordt onderdrukt door HOX genen, daarnaast nog vier:
 Sloppy paired (segment-polarity)
 Engrailed (segment-polarity)
 Extradentical
 Homothorax

Verschillen in HOXC-6 expressie zorgen ervoor dat nekwervels op andere plekken beginnen in muis
en kip

Hoofdstuk 14: Genomes and genomes
Genoom projecten: het klonen en sequencen van het hele genoom van een geselecteerd organisme
 Human Genome Project: laat zien hoe wetenschap, technologie, het bedrijfsleven, de politiek
en ethiek elkaar beïnvloeden

ddNTP’s: bevatten dideoxyribose i.p.v. deoxyribose, als deze wordt ingebouwd kan de keten niet
verder worden gesynthetiseerd

, Sanger sequencing: stuk DNA, primer, dNTP’s. TAQ polymerase en
ddNTP’s  PCR reactie, beperkingen:
 Slechtere kwaliteit
 Geeft relatief lange ‘reads’ van goede kwaliteit

Genen die in de natuur voorkomen zijn niet langer te patenteren, maar
synthetisch DNA wel, bijvoorbeeld:
 Gemodificeerde genen
 cDNA

Whole-genome shotgun sequencing: een lang chromosoom wordt in
kleine stukjes verdeeld en van elk stukje wordt de sequentie bepaald, de
overlap tussen de reads wordt gebruikt om alles aan elkaar te puzzelen

Pyrosequencing: (454 sequencing), omste beurt wordt dATP, dGTP,
dCTP en dTTP toegevoegd en als de dNTP bindt dan is er een
lichtflitsje en dit geeft aan welke base op die plek zit
 DNA moleculen in miljoenen kleine random stukjes knippen
(overlappende klein segmenten)
 Elke klein segment sequencen met PCR
 Overlap tussen de kleine segmenten vinden waar de
sequenties gelijk zijn (contig)
 Steeds grotere stukjes overlappen totdat alle segmenten
gekoppeld zijn (lukt meestal niet!  gaten)


Truc om overlap te creëren zonder genenkaart:
 Circulation adapters aan uiteinde van DNA fragment ligeren
(20, 8 of 3 kb)
 Adapters aan elkaar  cirkelvormig DNA molecuul
 Dit cirkelvormig DNA molecuul wordt in stukjes geknipt en
selecteer de stukjes met de ‘circulization adapters’
 Afstand tussen de rode stukjes is dus 20, 8 of 3 kb
 Adapters A en B aan de eindes van het fragment ligeren
 Fragmenten met adapters amplificeren met PCR
 Kijken of je de gaten op kunt vullen met de paired-end reads

The Institute for Genomic Research was binnen een jaar klaar met
sequencen van het genoom
 Veel minder genen bij de mens dan gedacht
 Het humane genoom is van iedereen en de private sector moet dus haar data delen
 Volledige genoom was in 2003 klaar

Goedkopere technologieën hebben kortere reads en maken meer foutjes
Met goedkopere technologieën moet je dus vaker dieper sequencen (elke base vaker sequencen)
Technologieën en prijzen veranderen elk jaar

Gen annotatie: de samenstelling van het gen bepalen
EST: eindes van het coderende stuk van het gen