Samenvatting moleculaire pathologie
Inhoudsopgave
Moleculaire technieken I .................................................................................................................................. 2
Basis pathologie ................................................................................................................................................. 2
FISH..................................................................................................................................................................... 3
PCR ..................................................................................................................................................................... 4
Moleculaire technieken II ................................................................................................................................. 6
Sanger sequensing.............................................................................................................................................. 6
MLPA .................................................................................................................................................................. 7
Short tandem repeats ....................................................................................................................................... 11
Signaalroutes ................................................................................................................................................. 13
EGFR signaalroute ............................................................................................................................................ 15
WNT signaalroute............................................................................................................................................. 19
Next generation sequencing........................................................................................................................... 20
Ion Torrent NGS ................................................................................................................................................ 21
Whole exome sequencing ................................................................................................................................. 24
Kiembaan bevindingen ..................................................................................................................................... 27
Lynch syndroom ............................................................................................................................................. 27
Primer ontwerp en kwaliteit controle ............................................................................................................... 29
Liquid biopsies ............................................................................................................................................... 31
ddPCR ............................................................................................................................................................... 32
AS-PCR .............................................................................................................................................................. 34
Oncologische longpathologie ......................................................................................................................... 34
Arrays............................................................................................................................................................. 37
SNP array .......................................................................................................................................................... 37
Methylatie arrays ............................................................................................................................................. 40
Oncologische borstpathologie ........................................................................................................................ 41
BRCA1/2 bij borsttumoren ................................................................................................................................ 44
Translocaties en gen fusies ............................................................................................................................. 46
Hematologische oncologie ............................................................................................................................. 50
Klonaliteitsdetectie ........................................................................................................................................... 50
Maligne lymfomen ........................................................................................................................................... 53
Melanomen.................................................................................................................................................... 54
,Practica .......................................................................................................................................................... 55
Identifying a tissue source ................................................................................................................................ 55
Detection of a mutation in the KRAS and EGFR gene ....................................................................................... 57
Determination of Lynch .................................................................................................................................... 59
Determination of amplification of the Her2/neu .............................................................................................. 61
Moleculaire technieken I
Basis pathologie
Lab proces pathologie:
1. Biopten of resecties worden naar de afdeling pathologie gestuurd
2. Macrodissectie → kiezen welk deel van een biopt/resectie wordt geanalyseerd
3. Plaatsen van het weefsel in een cassette
4. Fixeren van het weefsel, dit gebeurt meestal met behulp van formaldehyde wat zorgt
voor cross-links tussen eiwitten waardoor een soort netwerk ontstaat. Echter, het
veroorzaakt schade in het DNA.
5. Het weefsel wordt gewassen, gehydrateerd en ingebed in paraffine (een soort wax). Er
wordt nu naar het weefsel verwezen als: formalin fixed paraffin embedded (FFPE).
6. Het weefsel wordt in dunne laagje gesneden.
7. Kleuren van het weefsel. Dit kan op verschillende manieren waarbij onderscheidt
gemaakt wordt tussen:
• Contrastkleuring (H&E, alcian blue)
• Immunohistochemische kleuring (IHC), waarbij specifieke primaire
antilichamen worden gebruikt. Aan de ‘staart’ van het primaire antilichaam
bindt een secundair antilichaam wat is voorzien van een peroxidase. Deze zal
bruin kleuren na toevoeging van het substraat. Als voorbereiding zal het
weefsel antigen retrieval ondergaan, hierbij wordt het weefsel gekookt
waardoor de eiwitten denatureren en de antilichamen beter kunnen binden.
8. Beoordeling door de patholoog
9. Inscannen van de beelden
Soorten specifieke markers en hun functie:
• Linage-specific markers → zijn specifiek voor een bepaald soort weefsel en worden
dus gebruikt om te bepalen om wat voor weefsel het gaat.
, • Biomarkers → binden op specifiek gemuteerde eiwitten, deze worden vaak gebruikt
om therapie opties aan te tonen.
• Behavior markers → markers die binden op eiwitten die iets zeggen over het gedrag
van het weefsel. Ze kunnen bijvoorbeeld iets zeggen over de hoeveelheid delende
cellen of hoeveelheid immunofiltraat in het weefsel.
Vaak wordt een combinatie van verschillende soorten markers gebruikt om de diagnose vast
te stellen.
De moleculaire pathologie is voornamelijk gefocust op DNA en RNA.
De fixeerstap aan het begin van het proces kan tot problemen leiden bij de moleculaire
biologie, formaldehyde kan immers DNA schade veroorzaken. Een andere mogelijkheid voor
het fixeren van weefsel is flash-freeze. Hierbij wordt het weefsel heel snel ingevroren. H&E
werkt wel bij deze fixeermanier maar sommige IHC’s niet.
Twee opties voor DNA analyse:
• In situ → bekijken van het DNA in een coupe (bijv. bij FISH)
• In vitro → DNA afkomstig uit een preparaat bekijken in een epje.
FISH
Bij deze analysemethode wordt er gebruik gemaakt van DNA-probes, dit zijn stukjes DNA
die complementair zijn aan het DNA van interesse. De DNA-probes zijn fluorescent gelabeld
waardoor aanwezigheid van specifieke DNA sequenties kan worden aangetoond door middel
van fluorescent signaal.
Procedure:
* Door middel van een DAPI kleuring kunnen kernen blauw gekleurd worden
Soorten FISH
• Break apart FISH → er wordt gebruik gemaakt van twee probes met een andere
fluorescente labeling. De probes zijn complementair aan stukken DNA die op
hetzelfde gen dicht bij elkaar liggen. In een normale cel zal hierdoor fluorescent
signaal bij elkaar gedetecteerd worden met overlap in kleur. In een tumorcel waar
sprake is van een (deels) translocatie, zal het fluorescente signaal apart van elkaar
gedetecteerd worden.
, • Amplificatie FISH → Hierbij wordt zowel een gen als een centromeer fluorescent
gekleurd, door de onderlinge verhouding kan amplificatie aangetoond worden. Hierbij
wordt het centromeer gelabeld met een groen fluorescerende probe en het target gen
met een rood fluorescerende probe. In onderstaand afbeelding is duidelijk sprake van
een geamplificeerd gen.
* Rood = target gen, groen = centromeer
PCR
* Verderop in de samenvatting worden nog meer soorten PCR besproken *
Standaard PCR
Bij het runnen van een standaard PCR zorgen de analysen dat alleen tumorcellen gerund
worden. Anders zal het tumor DNA verontreinigd worden met gezond DNA waardoor de
afwijken als het ware verdund zullen worden. PCR stappen:
• Denaturation (98 C) → waterstofbruggen tussen de beide DNA strengen worden
verbroken.
• Annealing (55-65 C) → De primers binden aan het target DNA.
• Extention (72 C) → Tag polymerase synthetiseert nieuw complementair DNA met
behulp van vrije dNTP’s
Bovenstaande stappen worden tot 40 keer herhaald.
Inhoudsopgave
Moleculaire technieken I .................................................................................................................................. 2
Basis pathologie ................................................................................................................................................. 2
FISH..................................................................................................................................................................... 3
PCR ..................................................................................................................................................................... 4
Moleculaire technieken II ................................................................................................................................. 6
Sanger sequensing.............................................................................................................................................. 6
MLPA .................................................................................................................................................................. 7
Short tandem repeats ....................................................................................................................................... 11
Signaalroutes ................................................................................................................................................. 13
EGFR signaalroute ............................................................................................................................................ 15
WNT signaalroute............................................................................................................................................. 19
Next generation sequencing........................................................................................................................... 20
Ion Torrent NGS ................................................................................................................................................ 21
Whole exome sequencing ................................................................................................................................. 24
Kiembaan bevindingen ..................................................................................................................................... 27
Lynch syndroom ............................................................................................................................................. 27
Primer ontwerp en kwaliteit controle ............................................................................................................... 29
Liquid biopsies ............................................................................................................................................... 31
ddPCR ............................................................................................................................................................... 32
AS-PCR .............................................................................................................................................................. 34
Oncologische longpathologie ......................................................................................................................... 34
Arrays............................................................................................................................................................. 37
SNP array .......................................................................................................................................................... 37
Methylatie arrays ............................................................................................................................................. 40
Oncologische borstpathologie ........................................................................................................................ 41
BRCA1/2 bij borsttumoren ................................................................................................................................ 44
Translocaties en gen fusies ............................................................................................................................. 46
Hematologische oncologie ............................................................................................................................. 50
Klonaliteitsdetectie ........................................................................................................................................... 50
Maligne lymfomen ........................................................................................................................................... 53
Melanomen.................................................................................................................................................... 54
,Practica .......................................................................................................................................................... 55
Identifying a tissue source ................................................................................................................................ 55
Detection of a mutation in the KRAS and EGFR gene ....................................................................................... 57
Determination of Lynch .................................................................................................................................... 59
Determination of amplification of the Her2/neu .............................................................................................. 61
Moleculaire technieken I
Basis pathologie
Lab proces pathologie:
1. Biopten of resecties worden naar de afdeling pathologie gestuurd
2. Macrodissectie → kiezen welk deel van een biopt/resectie wordt geanalyseerd
3. Plaatsen van het weefsel in een cassette
4. Fixeren van het weefsel, dit gebeurt meestal met behulp van formaldehyde wat zorgt
voor cross-links tussen eiwitten waardoor een soort netwerk ontstaat. Echter, het
veroorzaakt schade in het DNA.
5. Het weefsel wordt gewassen, gehydrateerd en ingebed in paraffine (een soort wax). Er
wordt nu naar het weefsel verwezen als: formalin fixed paraffin embedded (FFPE).
6. Het weefsel wordt in dunne laagje gesneden.
7. Kleuren van het weefsel. Dit kan op verschillende manieren waarbij onderscheidt
gemaakt wordt tussen:
• Contrastkleuring (H&E, alcian blue)
• Immunohistochemische kleuring (IHC), waarbij specifieke primaire
antilichamen worden gebruikt. Aan de ‘staart’ van het primaire antilichaam
bindt een secundair antilichaam wat is voorzien van een peroxidase. Deze zal
bruin kleuren na toevoeging van het substraat. Als voorbereiding zal het
weefsel antigen retrieval ondergaan, hierbij wordt het weefsel gekookt
waardoor de eiwitten denatureren en de antilichamen beter kunnen binden.
8. Beoordeling door de patholoog
9. Inscannen van de beelden
Soorten specifieke markers en hun functie:
• Linage-specific markers → zijn specifiek voor een bepaald soort weefsel en worden
dus gebruikt om te bepalen om wat voor weefsel het gaat.
, • Biomarkers → binden op specifiek gemuteerde eiwitten, deze worden vaak gebruikt
om therapie opties aan te tonen.
• Behavior markers → markers die binden op eiwitten die iets zeggen over het gedrag
van het weefsel. Ze kunnen bijvoorbeeld iets zeggen over de hoeveelheid delende
cellen of hoeveelheid immunofiltraat in het weefsel.
Vaak wordt een combinatie van verschillende soorten markers gebruikt om de diagnose vast
te stellen.
De moleculaire pathologie is voornamelijk gefocust op DNA en RNA.
De fixeerstap aan het begin van het proces kan tot problemen leiden bij de moleculaire
biologie, formaldehyde kan immers DNA schade veroorzaken. Een andere mogelijkheid voor
het fixeren van weefsel is flash-freeze. Hierbij wordt het weefsel heel snel ingevroren. H&E
werkt wel bij deze fixeermanier maar sommige IHC’s niet.
Twee opties voor DNA analyse:
• In situ → bekijken van het DNA in een coupe (bijv. bij FISH)
• In vitro → DNA afkomstig uit een preparaat bekijken in een epje.
FISH
Bij deze analysemethode wordt er gebruik gemaakt van DNA-probes, dit zijn stukjes DNA
die complementair zijn aan het DNA van interesse. De DNA-probes zijn fluorescent gelabeld
waardoor aanwezigheid van specifieke DNA sequenties kan worden aangetoond door middel
van fluorescent signaal.
Procedure:
* Door middel van een DAPI kleuring kunnen kernen blauw gekleurd worden
Soorten FISH
• Break apart FISH → er wordt gebruik gemaakt van twee probes met een andere
fluorescente labeling. De probes zijn complementair aan stukken DNA die op
hetzelfde gen dicht bij elkaar liggen. In een normale cel zal hierdoor fluorescent
signaal bij elkaar gedetecteerd worden met overlap in kleur. In een tumorcel waar
sprake is van een (deels) translocatie, zal het fluorescente signaal apart van elkaar
gedetecteerd worden.
, • Amplificatie FISH → Hierbij wordt zowel een gen als een centromeer fluorescent
gekleurd, door de onderlinge verhouding kan amplificatie aangetoond worden. Hierbij
wordt het centromeer gelabeld met een groen fluorescerende probe en het target gen
met een rood fluorescerende probe. In onderstaand afbeelding is duidelijk sprake van
een geamplificeerd gen.
* Rood = target gen, groen = centromeer
PCR
* Verderop in de samenvatting worden nog meer soorten PCR besproken *
Standaard PCR
Bij het runnen van een standaard PCR zorgen de analysen dat alleen tumorcellen gerund
worden. Anders zal het tumor DNA verontreinigd worden met gezond DNA waardoor de
afwijken als het ware verdund zullen worden. PCR stappen:
• Denaturation (98 C) → waterstofbruggen tussen de beide DNA strengen worden
verbroken.
• Annealing (55-65 C) → De primers binden aan het target DNA.
• Extention (72 C) → Tag polymerase synthetiseert nieuw complementair DNA met
behulp van vrije dNTP’s
Bovenstaande stappen worden tot 40 keer herhaald.
