Analytische biochemie I
Inhoud
Hoofdstuk 1 : inleiding.................................................................................4
Design van een biochemisch experiment.................................................5
Hoe kunnen we het moleculair gewicht van een eiwit bepalen?.............7
Meeteenheden..........................................................................................9
Concentraties............................................................................................9
Mol en molaire massa.............................................................................10
Elektrolyten................................................................................................11
Ionische sterkte...................................................................................11
Activiteit en activiteitscoëfficiënt............................................................13
Hoofdstuk 3 : filtratie en precipitatie.........................................................14
Dieptefilters............................................................................................14
Dieptefilters : glasvezelfilters..............................................................16
Oppervlaktefilters of membraanfilters....................................................16
Oppervlaktefilters : nitrocellulose........................................................17
Oppervlaktefilters : polycarbonaatfilters.............................................18
Oppervlaktefilters : nylonfilter.............................................................19
Oppervlaktefilters : celluloseacetaat filter...........................................19
Oppervlaktefilters : PTFE (teflon) filter................................................19
Toepassingen..........................................................................................21
Dialyse....................................................................................................24
Omgekeerde dialyse............................................................................25
Ultrafiltratie (= convectie)......................................................................26
Ultrafiltratie flux...................................................................................28
Tangentiële crossflow...........................................................................29
Vergelijking van verschillende methoden...............................................31
Precipitatie van eiwitten.........................................................................31
Kosmotrope en chaotrope zouten...........................................................34
Hoe kan een kosmotroop werken?.......................................................35
Hoe kan een chaotroop werken?..........................................................35
1
, Isoelektrische precipitatie.......................................................................35
Precipitatie in organische solventen.......................................................36
Immunoprecipitatie.................................................................................36
Co-immunoprecipitatie...........................................................................37
Hoofdstuk 6 : elektroforese........................................................................38
Formules.................................................................................................38
Wet van Stokes.......................................................................................39
Elektroforese en ionische sterkte............................................................39
Dunne laag elektroforese........................................................................41
één en twee dimensionale dunne laag elektroforese..........................41
Gelelektroforese......................................................................................42
Agarose gel elektroforese....................................................................42
Poriegrootte en scheidend vermogen..................................................42
Relatie tussen afgelegde weg en massa vh nucleinezuur...................44
Staalvoorbereiding...............................................................................45
Aangelegd voltage...............................................................................46
Duurtijd vd scheiding...........................................................................46
Visualiseren van nucleïnezuren in agarose gel.......................................47
Interpretatie van de resultaten...............................................................47
Polyacyrlamide gel elektroforese............................................................48
Verhouding acrylamide en bisacrylamide............................................49
Verticale elektroforese.........................................................................50
Verschillende types polyacrylamide elektroforese...............................50
Discontinue gelsysteem.......................................................................53
Kleuring van polyacrylamide gels........................................................55
Interpretatie van de resultaten............................................................57
Iso elektrisch punt of pI...........................................................................57
Iso-elektrofocusing..................................................................................57
Carrier amfolieten................................................................................58
Immobilines.........................................................................................59
2D-gel elektroforese...............................................................................60
Downstream applicaties..........................................................................60
Western blotting..................................................................................61
2
, Southern en Northern blotting.............................................................63
Capillaire elektroforese...........................................................................64
Combinatie van elektro-osmose en elektroforese...................................65
3
, Hoofdstuk 1 : inleiding
Biochemie = studie van chemische processen in levende organismen met
als doel het begrijpen van het moleculaire werkingsmechanisme van de
cel
Technieken omvatten :
Staalvoorbereiding : welke stalen hebben we nodig, hoeveel
hebben we nodig, hoe zuiver is dat staal, oorsprong,…
Zuivering en isolatie van biocomponenten uit dit staal :
biocomponenten isoleren of kunnen we staal zo gebruiken?
elke stap = verlies van materiaal en misschien aanpassing van
eigenschap vh staal en effect op functie v biocomponent
biocomponent identificeren, karakteriseren en kwantificeren
!! in vitro => complexe situatie eenvoudiger maken = eenvoudiger,
gemakkelijker te interpreteren
MAAR : minder overeenkomst met fysiologische situatie
In vivo
- werken met humane stalen/proefdieren = heel kostbaar!!
Enkel gebruiken wnr je je proef al X aantal keer in vitro hebt gedaan of
op andere stalen
Enkel wnr je een heel duidelijk plan hebt
Gebruiken wnr je een resultaat al X aantal keer bekomen bent en je dit
wil bevestigen
!! wanneer je in vivo werkt moet je kunnen aantonen dat het iets
gaat opbrengen
4
Inhoud
Hoofdstuk 1 : inleiding.................................................................................4
Design van een biochemisch experiment.................................................5
Hoe kunnen we het moleculair gewicht van een eiwit bepalen?.............7
Meeteenheden..........................................................................................9
Concentraties............................................................................................9
Mol en molaire massa.............................................................................10
Elektrolyten................................................................................................11
Ionische sterkte...................................................................................11
Activiteit en activiteitscoëfficiënt............................................................13
Hoofdstuk 3 : filtratie en precipitatie.........................................................14
Dieptefilters............................................................................................14
Dieptefilters : glasvezelfilters..............................................................16
Oppervlaktefilters of membraanfilters....................................................16
Oppervlaktefilters : nitrocellulose........................................................17
Oppervlaktefilters : polycarbonaatfilters.............................................18
Oppervlaktefilters : nylonfilter.............................................................19
Oppervlaktefilters : celluloseacetaat filter...........................................19
Oppervlaktefilters : PTFE (teflon) filter................................................19
Toepassingen..........................................................................................21
Dialyse....................................................................................................24
Omgekeerde dialyse............................................................................25
Ultrafiltratie (= convectie)......................................................................26
Ultrafiltratie flux...................................................................................28
Tangentiële crossflow...........................................................................29
Vergelijking van verschillende methoden...............................................31
Precipitatie van eiwitten.........................................................................31
Kosmotrope en chaotrope zouten...........................................................34
Hoe kan een kosmotroop werken?.......................................................35
Hoe kan een chaotroop werken?..........................................................35
1
, Isoelektrische precipitatie.......................................................................35
Precipitatie in organische solventen.......................................................36
Immunoprecipitatie.................................................................................36
Co-immunoprecipitatie...........................................................................37
Hoofdstuk 6 : elektroforese........................................................................38
Formules.................................................................................................38
Wet van Stokes.......................................................................................39
Elektroforese en ionische sterkte............................................................39
Dunne laag elektroforese........................................................................41
één en twee dimensionale dunne laag elektroforese..........................41
Gelelektroforese......................................................................................42
Agarose gel elektroforese....................................................................42
Poriegrootte en scheidend vermogen..................................................42
Relatie tussen afgelegde weg en massa vh nucleinezuur...................44
Staalvoorbereiding...............................................................................45
Aangelegd voltage...............................................................................46
Duurtijd vd scheiding...........................................................................46
Visualiseren van nucleïnezuren in agarose gel.......................................47
Interpretatie van de resultaten...............................................................47
Polyacyrlamide gel elektroforese............................................................48
Verhouding acrylamide en bisacrylamide............................................49
Verticale elektroforese.........................................................................50
Verschillende types polyacrylamide elektroforese...............................50
Discontinue gelsysteem.......................................................................53
Kleuring van polyacrylamide gels........................................................55
Interpretatie van de resultaten............................................................57
Iso elektrisch punt of pI...........................................................................57
Iso-elektrofocusing..................................................................................57
Carrier amfolieten................................................................................58
Immobilines.........................................................................................59
2D-gel elektroforese...............................................................................60
Downstream applicaties..........................................................................60
Western blotting..................................................................................61
2
, Southern en Northern blotting.............................................................63
Capillaire elektroforese...........................................................................64
Combinatie van elektro-osmose en elektroforese...................................65
3
, Hoofdstuk 1 : inleiding
Biochemie = studie van chemische processen in levende organismen met
als doel het begrijpen van het moleculaire werkingsmechanisme van de
cel
Technieken omvatten :
Staalvoorbereiding : welke stalen hebben we nodig, hoeveel
hebben we nodig, hoe zuiver is dat staal, oorsprong,…
Zuivering en isolatie van biocomponenten uit dit staal :
biocomponenten isoleren of kunnen we staal zo gebruiken?
elke stap = verlies van materiaal en misschien aanpassing van
eigenschap vh staal en effect op functie v biocomponent
biocomponent identificeren, karakteriseren en kwantificeren
!! in vitro => complexe situatie eenvoudiger maken = eenvoudiger,
gemakkelijker te interpreteren
MAAR : minder overeenkomst met fysiologische situatie
In vivo
- werken met humane stalen/proefdieren = heel kostbaar!!
Enkel gebruiken wnr je je proef al X aantal keer in vitro hebt gedaan of
op andere stalen
Enkel wnr je een heel duidelijk plan hebt
Gebruiken wnr je een resultaat al X aantal keer bekomen bent en je dit
wil bevestigen
!! wanneer je in vivo werkt moet je kunnen aantonen dat het iets
gaat opbrengen
4
