Farmacologie: GM & hun targets
Inhoudsopgave
1 Inleiding tot enzymen, receptoren & effect van GM ......................................................4
1.1 Communicatie tussen cellen: de rol van enzymen & receptoren ....................................... 4
1.1.1 enzymen ......................................................................................................................................... 4
1.1.2 receptoren ...................................................................................................................................... 4
1.1.3 enzymen & receptoren................................................................................................................. 12
1.2 Het effect van GM .......................................................................................................... 13
1.3 Classificatie GM .............................................................................................................. 16
2 Membranen & strucuur niet-specifieke GM ................................................................ 17
2.1 Thermodynamische activiteit.......................................................................................... 17
2.2 Voorbeelden ................................................................................................................... 19
2.2.1 anesthetica ................................................................................................................................... 19
2.2.2 bacteriedodende concentratie v organische verbindingen.......................................................... 21
2.2.3 bacteriedodende activiteit v alifatische alcoholen & amines & hun wateroplosbaarheid .......... 21
2.3 Werkingsmechanisme gasvormige anesthetica ............................................................... 22
2.4 Bespreking van anesthetica ............................................................................................ 24
3 Bindingen betrokken bij de vorming van GM-receptor complexen .............................. 28
3.1 bindingen betrokken bij GM-receptor interacties ........................................................... 31
3.2 covalente binding ........................................................................................................... 32
3.2.1 Niet-specifieke covalente bindingen ............................................................................................ 32
3.2.2 Alkylerende producten ................................................................................................................. 34
3.2.3 Fosforylering................................................................................................................................. 40
3.2.4 Acylering ....................................................................................................................................... 44
3.2.5 Michael additie ............................................................................................................................. 46
3.2.6 Vorming disulfide adducten ......................................................................................................... 48
3.2.7 Targeted covalent inhibitors (TCIs) .............................................................................................. 51
3.2.8 GM-target residence time ............................................................................................................ 54
3.3 Niet-covalente binding ................................................................................................... 59
3.3.1 elektrostatische interacties .......................................................................................................... 59
3.3.1.1 Ionische binding ....................................................................................................................... 60
3.3.1.2 Ion-dipool & dipool-dipool interacties ..................................................................................... 62
3.3.1.3 Ionisatie van GM ...................................................................................................................... 64
3.3.2 H-binding ...................................................................................................................................... 69
3.3.3 herdistributie van ladingen .......................................................................................................... 73
3.3.3.1 Geïnduceerde polarisatie ......................................................................................................... 73
3.3.3.2 “charge transfer”...................................................................................................................... 73
3.3.4 niet-polaire interacties ................................................................................................................. 74
3.3.4.1 Dispersie & afstotingskrachten ................................................................................................ 74
3.3.5 entropie-bijdrage ......................................................................................................................... 76
3.3.5.1 Algemeen entropieverlies door vorming GM-receptor complex ............................................. 76
3.3.5.2 Hydrofobe bindingen ............................................................................................................... 79
3.4 Descriptoren voor hydrofobiciteit, elektronische & sterische eigenschappen.................. 83
3.4.1 kwantificatie v hydrofobiciteit ..................................................................................................... 83
3.4.2 elektronische aspecten & pK ........................................................................................................ 87
3.4.3 sterische parameter & isosterie ................................................................................................... 91
3.4.3.1 Bio-isosteren ............................................................................................................................ 95
1
,4 Stereochemische aspecten ....................................................................................... 100
4.1 Isomerie van moleculen ................................................................................................ 100
4.2 Optische isomerie & enantiomeren .............................................................................. 101
4.2.1 nomenclatuur ............................................................................................................................. 102
4.2.2 polarimetrie ................................................................................................................................ 103
4.2.3 chirale GM ten gevolge van asymmetrische atomen (> C) ......................................................... 105
4.2.3.1 Asymmetrische C-atomen ...................................................................................................... 105
4.2.3.2 Asymmetrische N-atomen ..................................................................................................... 105
4.2.3.3 Asymmetrische P-atomen ...................................................................................................... 106
4.2.3.4 Asymmetrische S-atomen ...................................................................................................... 107
4.2.4 direct effect van stereochemie op farmacologische activiteit ................................................... 108
4.2.4.1 Prochiraliteit ........................................................................................................................... 113
4.2.5 indirect effect van stereochemie op farmacologische activiteit ................................................ 116
4.2.5.1 Absorptie (opname) ............................................................................................................... 116
4.2.5.2 Distributie............................................................................................................................... 116
4.2.5.3 Metabolisatie ......................................................................................................................... 117
4.2.5.4 Klaring .................................................................................................................................... 117
4.2.6 chiral switch................................................................................................................................ 118
4.3 Geometrische isomerie ................................................................................................. 119
4.3.1 geometrische isomeren door de aanwezigheid van een C=C binding ........................................ 120
4.3.2 geometrische isomeren door de aanwezigheid van een dubbele binding waarbij heteroatomen
betrokken zijn ............................................................................................................................................. 120
4.3.3 geometrische isomeren bij cyclische systemen ......................................................................... 123
4.3.4 conformatie-isomerie ................................................................................................................. 124
4.3.4.1 Acyclische systemen ............................................................................................................... 125
4.3.4.2 Cyclische systemen ................................................................................................................ 129
4.3.5 resolutie ..................................................................................................................................... 129
5 Methoden om receptoren te bestuderen .................................................................. 130
5.1 Receptorbidnigsexperimenten ...................................................................................... 130
5.1.1 saturatie-experimenten ............................................................................................................. 131
5.1.2 competitie-experimenten .......................................................................................................... 132
5.2 Indirecte methoden ...................................................................................................... 134
5.3 Directe methoden......................................................................................................... 135
5.3.1 klassieke zuiveringsmethoden.................................................................................................... 136
5.3.1.1 Iso-elektrisch focusseren........................................................................................................ 136
5.3.1.2 Tweedimensionele elektroforese........................................................................................... 136
5.3.1.3 Gelexclusie chromatografie ................................................................................................... 137
5.3.1.4 Hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) ............................................................................. 137
5.3.2 affiniteitsmethoden.................................................................................................................... 137
5.3.2.1 Affiteitschromatografie .......................................................................................................... 137
5.3.2.2 Affiniteitsmerking................................................................................................................... 138
5.3.3 activity-based profiling (ABPP) ................................................................................................... 143
5.3.3.1 Activity-based probes (APBs) ................................................................................................. 143
5.3.3.2 Analytische platformen voor ABPP ........................................................................................ 144
5.3.3.3 Toepassingsgebieden ............................................................................................................. 145
5.3.3.4 Enzymklassen ......................................................................................................................... 147
5.3.3.5 Imuunaffiniteitschromatografie & immuunprecipitatie ........................................................ 152
5.3.4 methoden die gebruik maken v radioisotopen & fluorescentie indicatoren ............................. 153
5.3.4.1 Radio-isotopen ....................................................................................................................... 153
5.3.4.2 Fluorescerende moleculen ..................................................................................................... 154
5.3.5 X-straal kristallografie................................................................................................................. 155
5.3.6 Kernmagnetische resonantie ..................................................................................................... 155
2
, 5.3.7 recombinant DNA technologie ................................................................................................... 155
5.4 Dataverwerking ............................................................................................................ 155
6 Receptormodellen .................................................................................................... 156
6.1 Binding vs functional assays.......................................................................................... 157
6.2 “occupancy” theorie (Clark) .......................................................................................... 160
6.2.1 aangepaste occupancy theorie (Ariëns) ..................................................................................... 162
6.3 Andere theorieën ......................................................................................................... 170
6.3.1 “Charnière” theorie .................................................................................................................... 170
6.3.2 “spare receptor” theory ............................................................................................................. 173
6.3.3 “induced-fit” theorie (Koshland) ................................................................................................ 182
7 Receptoren & transmembraansignalisatie................................................................ 184
7.1 Voorbeelden van verschillende types receptoren ......................................................... 185
7.1.1 intracellulaire receptor ............................................................................................................... 185
7.1.2 1ste type: acetylcholinereceptor (nicotinereceptor) ................................................................... 187
7.1.3 2e type: insulinereceptor ............................................................................................................ 188
7.1.4 3e type: noradrenalinereceptor .................................................................................................. 191
7.1.4.1 Algemeen schema vd singaalstransductie (niet?) ................................................................. 191
7.2 G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCRs) .................................................................. 193
7.2.1 structuur GPCRs ......................................................................................................................... 193
7.2.2 klassen van GPCRs ..................................................................................................................... 197
7.2.3 rol van G-proteïne als regulator van effectorsystemen ............................................................. 199
7.2.4 indeling van G-proteïnen ............................................................................................................ 204
7.2.5 arrestines (ß-arrestinen) ............................................................................................................ 205
7.2.6 heterodimere groepen ............................................................................................................... 205
7.3 “second messenger” systemen ..................................................................................... 206
7.3.1 cAMP systeem ............................................................................................................................ 206
7.3.2 cGMP systeem ............................................................................................................................ 209
7.3.2.1 Rol van cGMP in zichtproces .................................................................................................. 211
7.3.3 inositol systeem (niet) ................................................................................................................ 216
7.3.3.1 Ins(1,4,5)P3 receptor.............................................................................................................. 217
7.3.4 Ca2+ als intracellulaire messengerb ............................................................................................ 218
7.3.5 “biased” agonisme ..................................................................................................................... 221
7.3.6 functionele GPCR assays ............................................................................................................ 224
7.3.6.1 GTPgS bindingsassays (1)........................................................................................................ 225
7.3.6.2 Second messenger assays (2) ................................................................................................. 227
7.3.6.3 Gen reporter assays (3) .......................................................................................................... 229
3
,1 Inleiding tot enzymen, receptoren & effect van GM
1.1.1 ENZYMEN
niet?:
- Levende organismen: complexiteit enkelcellige protozoa " multicellulaire organismen (vb mens)
- Cellen v versch organismen: versch structuren & eigenschappen
• Prokaryote (bact) cel: geen celkern, gn mitoch, gn ontwikkeld ER
• Eukaryote (menselijke) cel: geen celwand (nodig vr bescherming proaryote cel)
- Cellen in organisme verschillen ook
- Cellen in hoger organisme: georganiseerd zodat cellen met gelijkaardige functie samen in
orgaan/ weefsel
- In alle cellen: chemische reacties
• Snelheid = gecontroleerd door natuurlijke katalysatoren, enzymen
• Enzymen = hoog MW moleculen (vnl prot) " katalyseren anabole & katabole reacties
§ Triviale naam: idee over reactie
§ Binnen (intracell) & buiten (extracell) cel
1.1.2 RECEPTOREN
- Activiteiten cellen coördineren: versch cellen in organisme moeten kunnen communiceren met
elkaar " via interactie met receptoren
• = vaak mbv kleinere moleculen
- 3 soorten chemische boodschappers:
1) Neurotransmitters:
• Chemische messengers, vrijgesteld uit zenuwuiteinden (neuron)
• Brengen signaal over naar volgende cel (ander neuron of vb gladde spiercel GI syst)
• Snel systeem
• Moleculen lokaal vrijgesteld
• Speciaal contact tss zenuwcel & “target” cel
• Werken op korte afstand (vrijgesteld in buurt v organen/receptoren)
• Vrijgesteld in hoge lokale concentraties (5.10-4 M)
zenuwuiteinde - synaps – receptoren – volgende cel
• vb: acetylcholine, epinefrine, dopamine
4
, 2) Hormonen:
• Geproduceerd door endocriene klieren & vrijgesteld in bloed
" kunnen small molecule GM die we oraal innemen beter
vgl met hormonen dan neurotransmitters want moeten via
bloed passeren
• Trager proces (want moeten via bloed getransporteerd w om targetorganen te bereiken)
• Getransporteerd via bloedstroom
• Werken op zeer grote afstand
• Zeer specifieke receptoren aanwezig
§ Want doorheen hele lichaam getransporteerd via bloed " moeten heel spec
zijn vr receptor (want komen er veel tegen)
§ <-> neurotransmitters: specificiteit minder belangr want vrijgegeven thv site of
action
• Werken bij lage concentraties (<10-8M) (ong 10nM)
• 2 types hormonen:
§ Wateroplosbare (peptide) hormonen
o Vb insuline
o Interageren met receptor in celmembraan "
hebben niet de fysicochemische eigenschappen om te diffunderen in
cel
o Respons gewoonlijk kort
§ WaterONoplosbare (steroïd) hormonen
o Vb testosteron
o Receptor gelokaliseerd binnenin cel " hebben juiste
eigenschappen om celmembraan te passeren
via diffusie
ð Hogere affiniteit & hoger specificiteit voor target receptoren
3) Lokale hormonen (niet?)
• Chemische signalen die werken in onmiddelijke omgeving
• Bereiken gewoonlijk eindorgaan via extracell vl
• Werken lokaal
• Snel geabsorbeerd of vernietigd
• Vb histamine uit mastcellen, prostaglandine E2
- Moleculen geven info door via interactie met receptoren op opp targetcel
- Reactie signaalmolecule (agonist/ neurotransmitter) met receptor "
conformatieverandering macromoleculaire receptor & mogelijks omliggende membraan (conf
verandering aan opp én binnenin)
è resultaat: (mebraangebonden) enzym in cel ge(de)activeerd / uitwisseling ionen tss intra- &
extracell omgeving (opening ionenkanaal)
- Agonist = product dat zelfde effect heeft als de natuurlijke molecule (neurotransmitter) "
veroorzaken zelfde cellulaire reacties
Membraangebonden enzymactivatie:
5
,- Binding ligand (agonist) " verandering conformatie receptor " actieve site (deel v receptor met
enzymatische activiteit gesloten " open)
1. Receptor niet bezet: actieve plaats gesloten " geen enzymatische activiteit
2. Boodschappermol bindt aan buitenkant receptor " conformatieverandering receptor "
enzymatisch gedeelte verandert => actieve plaats enzym toegankelijk => intracell werking
3. Substraat A omgezet nr product B " intracell veranderingen
- !! niet altijd sleutel-slot " vaak zoals hierboven: ligand & receptor veranderen conformatie
- Enzymactiviteit rechtstreeks gelinkt aan receptor: 1 geheel <-> meestal gecompliceerder (GPCRs)
- Activatie GPCR (G protein coupled receptor) " G prot w gerecruteerd nr geactiveerde receptor
" G prot activeren enzymen binnenin cel
1. Binding messenger op receptor " conformatieverandering intracell deel receptor
2. Conformatieverandering: niet rechtstreeks aan/uit " via G-prot (bolletjes) " receptoren =
G-prot gekoppeld
3. Activatie: binding G prot thv intracell zijde " door binding = verandering G prot
4. Ondergaat zelf conformatieverandering " dissociatie in 2 brokstukken
5. Brokstukken zelf: activatie enzymen (alfa-subeenheid kan binden aan enzym verankerd in
membraan)
6. Verandering conformatie enzym " activatie: inductie intracell veranderingen
è nettoresultaat = zelfde
è omweg via G-prot
6
,- Vb: noradrenaline & activatie adenylaatcyclase:
• Effect (enzymactiviteit) blijft doorgaan zolang receptor bezet is
§ Agonist niet op receptor: enzyme niet actief " ATP niet omgezet in cAMP
§ Agonist bindt aan receptor: enzyme actief " ATP => cAMP
§ Agonist lange tijd gebonden: enzymactiviteit verdwijnt weer
• cAMP: kan andere enzymatische reacties reguleren
Lock-gate mechanisme voor opening ionenkanalen
- Vb: acetylcholine & openen v ionenkanalen:
• Receptor gebonden met ionenkanaal
• Niet-gebonden (messenger): ionenkanaal gesloten
• Binding " ionenkanaal open " influx kationen in cel (volgens conc grad) " intracell
veranderingen
• Na sluiten kanaal: ionengrad hersteld door ionenpompen
• Effect kan herhaald w wnr agonist vrijgesteld is van receptor, systeem weer in originele
rusttoestand & agonist bindt weer aan receptor
• Struct ionenkanaal:
§ Ingebed in celmembraan
§ Interactie met fosfolipiden =
hydrofoob
§ Interactie met polaire
kationen/anionen = hydrofiel
7
,Hypothetische neurotransmitter en zijn receptor:
- 3 hoofdinteracties (tss boodschappermol & receptor bindingspl):
1) H-brug
2) VdW
3) Ionische binding
- Neurotransmitter: bindingsgroepen voor belangrijke interacties
• Benzeenring: voor VdW
• OH: voor H-brug
• Pos lading (amine): voor ionische binding " pos geladen (geprot) bij fysiologische pH
- Receptor: hydroxyl & carbonzuur in zijketens AZ
• OH (vb serine): H-brug
• pKa COOH ~ 5 " 100% COO- bij fysiologische pH (7,4)
- Ionische binding: interactie pos lading amine & neg lading carboxyl
- Receptor activeren: nood aan conformatieverandering " intracell effect
Induced fit:
- Eerst: groepen te ver voor goeie ionische interactie
- Conformationele verandering receptor (induced fit): groepen dichter " ionische interactie
Openen van de lock gate
- Binding aan receptor (gebonden aan ionenkanaal): ligand induceert conformatieverandering "
opening ionenkanaal
-
8
,‘echt’ voorbeeld conformatieverandering:
- Receptor kan ook ionkanaal vormen
- Prot: kn versch conformaties aannemenn
- Receptor in celmembraan:
• Intracell deel: ingebed in membraan
• Extracell deel: vormt bindingspl boodschappermol
- Brain switch
• Binding neurotransmitter (serotonine) aan tryptofaan residu (extracell deel, oranje) in
receptor " conformatieverandering die proline residu toelaat om trans-cis isomerizatie
te ondergaan
• Isomerizatie " shift locatie v alfa-helix die leucine bevat " deblokkeert ionenkanaal v
receptor (onderaan, bovenaanzicht)
• Open ionenkanaal " stroom over membraan & generatie elektrisch signaal
Spiegelbeeld van hypothetische neurotransmitter
- Spiegelbeeld: kan maar 2 interacties aangaan van de 3 " hydroxylgr verkeerd georiënteerd =>
geen interactie
- Minder affiniteit " slaagt vermoedelijk niet in activatie
- Enzymen = chiraal " leiden altijd tot stereochemisch zuivere bindingen
9
, Belang van grootte & vorm
- Kleine verandering aan ligand kan grote invloed hebben op binding
- Vb kleine methylgroep op N vervangen door propyl " molecule te groot voor bindingssite
- Structurele complementariteit nodig tss ligand & receptor !
Competiteve reversibele antagonist
- Alle nodige interacties zijn er al (vb pos lading al op juiste pl) " induceert geen
conformatieverandering " geen activatie receptor
- Eenvoudiger antagonist ontw: moet gwn goed binden " geen conformatieverandering
induceren
Partieel agonisme
- Induced fit = suboptimaal (in vgl met agonist)
- Partieel agonist kan op 2 manieren binden:
• Als agonist
• Als antagonist
- Verschillende receptoren met zelfde messenger :
• Agonist op ene subtype
• Antagonist op andere subtype
10
Inhoudsopgave
1 Inleiding tot enzymen, receptoren & effect van GM ......................................................4
1.1 Communicatie tussen cellen: de rol van enzymen & receptoren ....................................... 4
1.1.1 enzymen ......................................................................................................................................... 4
1.1.2 receptoren ...................................................................................................................................... 4
1.1.3 enzymen & receptoren................................................................................................................. 12
1.2 Het effect van GM .......................................................................................................... 13
1.3 Classificatie GM .............................................................................................................. 16
2 Membranen & strucuur niet-specifieke GM ................................................................ 17
2.1 Thermodynamische activiteit.......................................................................................... 17
2.2 Voorbeelden ................................................................................................................... 19
2.2.1 anesthetica ................................................................................................................................... 19
2.2.2 bacteriedodende concentratie v organische verbindingen.......................................................... 21
2.2.3 bacteriedodende activiteit v alifatische alcoholen & amines & hun wateroplosbaarheid .......... 21
2.3 Werkingsmechanisme gasvormige anesthetica ............................................................... 22
2.4 Bespreking van anesthetica ............................................................................................ 24
3 Bindingen betrokken bij de vorming van GM-receptor complexen .............................. 28
3.1 bindingen betrokken bij GM-receptor interacties ........................................................... 31
3.2 covalente binding ........................................................................................................... 32
3.2.1 Niet-specifieke covalente bindingen ............................................................................................ 32
3.2.2 Alkylerende producten ................................................................................................................. 34
3.2.3 Fosforylering................................................................................................................................. 40
3.2.4 Acylering ....................................................................................................................................... 44
3.2.5 Michael additie ............................................................................................................................. 46
3.2.6 Vorming disulfide adducten ......................................................................................................... 48
3.2.7 Targeted covalent inhibitors (TCIs) .............................................................................................. 51
3.2.8 GM-target residence time ............................................................................................................ 54
3.3 Niet-covalente binding ................................................................................................... 59
3.3.1 elektrostatische interacties .......................................................................................................... 59
3.3.1.1 Ionische binding ....................................................................................................................... 60
3.3.1.2 Ion-dipool & dipool-dipool interacties ..................................................................................... 62
3.3.1.3 Ionisatie van GM ...................................................................................................................... 64
3.3.2 H-binding ...................................................................................................................................... 69
3.3.3 herdistributie van ladingen .......................................................................................................... 73
3.3.3.1 Geïnduceerde polarisatie ......................................................................................................... 73
3.3.3.2 “charge transfer”...................................................................................................................... 73
3.3.4 niet-polaire interacties ................................................................................................................. 74
3.3.4.1 Dispersie & afstotingskrachten ................................................................................................ 74
3.3.5 entropie-bijdrage ......................................................................................................................... 76
3.3.5.1 Algemeen entropieverlies door vorming GM-receptor complex ............................................. 76
3.3.5.2 Hydrofobe bindingen ............................................................................................................... 79
3.4 Descriptoren voor hydrofobiciteit, elektronische & sterische eigenschappen.................. 83
3.4.1 kwantificatie v hydrofobiciteit ..................................................................................................... 83
3.4.2 elektronische aspecten & pK ........................................................................................................ 87
3.4.3 sterische parameter & isosterie ................................................................................................... 91
3.4.3.1 Bio-isosteren ............................................................................................................................ 95
1
,4 Stereochemische aspecten ....................................................................................... 100
4.1 Isomerie van moleculen ................................................................................................ 100
4.2 Optische isomerie & enantiomeren .............................................................................. 101
4.2.1 nomenclatuur ............................................................................................................................. 102
4.2.2 polarimetrie ................................................................................................................................ 103
4.2.3 chirale GM ten gevolge van asymmetrische atomen (> C) ......................................................... 105
4.2.3.1 Asymmetrische C-atomen ...................................................................................................... 105
4.2.3.2 Asymmetrische N-atomen ..................................................................................................... 105
4.2.3.3 Asymmetrische P-atomen ...................................................................................................... 106
4.2.3.4 Asymmetrische S-atomen ...................................................................................................... 107
4.2.4 direct effect van stereochemie op farmacologische activiteit ................................................... 108
4.2.4.1 Prochiraliteit ........................................................................................................................... 113
4.2.5 indirect effect van stereochemie op farmacologische activiteit ................................................ 116
4.2.5.1 Absorptie (opname) ............................................................................................................... 116
4.2.5.2 Distributie............................................................................................................................... 116
4.2.5.3 Metabolisatie ......................................................................................................................... 117
4.2.5.4 Klaring .................................................................................................................................... 117
4.2.6 chiral switch................................................................................................................................ 118
4.3 Geometrische isomerie ................................................................................................. 119
4.3.1 geometrische isomeren door de aanwezigheid van een C=C binding ........................................ 120
4.3.2 geometrische isomeren door de aanwezigheid van een dubbele binding waarbij heteroatomen
betrokken zijn ............................................................................................................................................. 120
4.3.3 geometrische isomeren bij cyclische systemen ......................................................................... 123
4.3.4 conformatie-isomerie ................................................................................................................. 124
4.3.4.1 Acyclische systemen ............................................................................................................... 125
4.3.4.2 Cyclische systemen ................................................................................................................ 129
4.3.5 resolutie ..................................................................................................................................... 129
5 Methoden om receptoren te bestuderen .................................................................. 130
5.1 Receptorbidnigsexperimenten ...................................................................................... 130
5.1.1 saturatie-experimenten ............................................................................................................. 131
5.1.2 competitie-experimenten .......................................................................................................... 132
5.2 Indirecte methoden ...................................................................................................... 134
5.3 Directe methoden......................................................................................................... 135
5.3.1 klassieke zuiveringsmethoden.................................................................................................... 136
5.3.1.1 Iso-elektrisch focusseren........................................................................................................ 136
5.3.1.2 Tweedimensionele elektroforese........................................................................................... 136
5.3.1.3 Gelexclusie chromatografie ................................................................................................... 137
5.3.1.4 Hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) ............................................................................. 137
5.3.2 affiniteitsmethoden.................................................................................................................... 137
5.3.2.1 Affiteitschromatografie .......................................................................................................... 137
5.3.2.2 Affiniteitsmerking................................................................................................................... 138
5.3.3 activity-based profiling (ABPP) ................................................................................................... 143
5.3.3.1 Activity-based probes (APBs) ................................................................................................. 143
5.3.3.2 Analytische platformen voor ABPP ........................................................................................ 144
5.3.3.3 Toepassingsgebieden ............................................................................................................. 145
5.3.3.4 Enzymklassen ......................................................................................................................... 147
5.3.3.5 Imuunaffiniteitschromatografie & immuunprecipitatie ........................................................ 152
5.3.4 methoden die gebruik maken v radioisotopen & fluorescentie indicatoren ............................. 153
5.3.4.1 Radio-isotopen ....................................................................................................................... 153
5.3.4.2 Fluorescerende moleculen ..................................................................................................... 154
5.3.5 X-straal kristallografie................................................................................................................. 155
5.3.6 Kernmagnetische resonantie ..................................................................................................... 155
2
, 5.3.7 recombinant DNA technologie ................................................................................................... 155
5.4 Dataverwerking ............................................................................................................ 155
6 Receptormodellen .................................................................................................... 156
6.1 Binding vs functional assays.......................................................................................... 157
6.2 “occupancy” theorie (Clark) .......................................................................................... 160
6.2.1 aangepaste occupancy theorie (Ariëns) ..................................................................................... 162
6.3 Andere theorieën ......................................................................................................... 170
6.3.1 “Charnière” theorie .................................................................................................................... 170
6.3.2 “spare receptor” theory ............................................................................................................. 173
6.3.3 “induced-fit” theorie (Koshland) ................................................................................................ 182
7 Receptoren & transmembraansignalisatie................................................................ 184
7.1 Voorbeelden van verschillende types receptoren ......................................................... 185
7.1.1 intracellulaire receptor ............................................................................................................... 185
7.1.2 1ste type: acetylcholinereceptor (nicotinereceptor) ................................................................... 187
7.1.3 2e type: insulinereceptor ............................................................................................................ 188
7.1.4 3e type: noradrenalinereceptor .................................................................................................. 191
7.1.4.1 Algemeen schema vd singaalstransductie (niet?) ................................................................. 191
7.2 G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCRs) .................................................................. 193
7.2.1 structuur GPCRs ......................................................................................................................... 193
7.2.2 klassen van GPCRs ..................................................................................................................... 197
7.2.3 rol van G-proteïne als regulator van effectorsystemen ............................................................. 199
7.2.4 indeling van G-proteïnen ............................................................................................................ 204
7.2.5 arrestines (ß-arrestinen) ............................................................................................................ 205
7.2.6 heterodimere groepen ............................................................................................................... 205
7.3 “second messenger” systemen ..................................................................................... 206
7.3.1 cAMP systeem ............................................................................................................................ 206
7.3.2 cGMP systeem ............................................................................................................................ 209
7.3.2.1 Rol van cGMP in zichtproces .................................................................................................. 211
7.3.3 inositol systeem (niet) ................................................................................................................ 216
7.3.3.1 Ins(1,4,5)P3 receptor.............................................................................................................. 217
7.3.4 Ca2+ als intracellulaire messengerb ............................................................................................ 218
7.3.5 “biased” agonisme ..................................................................................................................... 221
7.3.6 functionele GPCR assays ............................................................................................................ 224
7.3.6.1 GTPgS bindingsassays (1)........................................................................................................ 225
7.3.6.2 Second messenger assays (2) ................................................................................................. 227
7.3.6.3 Gen reporter assays (3) .......................................................................................................... 229
3
,1 Inleiding tot enzymen, receptoren & effect van GM
1.1.1 ENZYMEN
niet?:
- Levende organismen: complexiteit enkelcellige protozoa " multicellulaire organismen (vb mens)
- Cellen v versch organismen: versch structuren & eigenschappen
• Prokaryote (bact) cel: geen celkern, gn mitoch, gn ontwikkeld ER
• Eukaryote (menselijke) cel: geen celwand (nodig vr bescherming proaryote cel)
- Cellen in organisme verschillen ook
- Cellen in hoger organisme: georganiseerd zodat cellen met gelijkaardige functie samen in
orgaan/ weefsel
- In alle cellen: chemische reacties
• Snelheid = gecontroleerd door natuurlijke katalysatoren, enzymen
• Enzymen = hoog MW moleculen (vnl prot) " katalyseren anabole & katabole reacties
§ Triviale naam: idee over reactie
§ Binnen (intracell) & buiten (extracell) cel
1.1.2 RECEPTOREN
- Activiteiten cellen coördineren: versch cellen in organisme moeten kunnen communiceren met
elkaar " via interactie met receptoren
• = vaak mbv kleinere moleculen
- 3 soorten chemische boodschappers:
1) Neurotransmitters:
• Chemische messengers, vrijgesteld uit zenuwuiteinden (neuron)
• Brengen signaal over naar volgende cel (ander neuron of vb gladde spiercel GI syst)
• Snel systeem
• Moleculen lokaal vrijgesteld
• Speciaal contact tss zenuwcel & “target” cel
• Werken op korte afstand (vrijgesteld in buurt v organen/receptoren)
• Vrijgesteld in hoge lokale concentraties (5.10-4 M)
zenuwuiteinde - synaps – receptoren – volgende cel
• vb: acetylcholine, epinefrine, dopamine
4
, 2) Hormonen:
• Geproduceerd door endocriene klieren & vrijgesteld in bloed
" kunnen small molecule GM die we oraal innemen beter
vgl met hormonen dan neurotransmitters want moeten via
bloed passeren
• Trager proces (want moeten via bloed getransporteerd w om targetorganen te bereiken)
• Getransporteerd via bloedstroom
• Werken op zeer grote afstand
• Zeer specifieke receptoren aanwezig
§ Want doorheen hele lichaam getransporteerd via bloed " moeten heel spec
zijn vr receptor (want komen er veel tegen)
§ <-> neurotransmitters: specificiteit minder belangr want vrijgegeven thv site of
action
• Werken bij lage concentraties (<10-8M) (ong 10nM)
• 2 types hormonen:
§ Wateroplosbare (peptide) hormonen
o Vb insuline
o Interageren met receptor in celmembraan "
hebben niet de fysicochemische eigenschappen om te diffunderen in
cel
o Respons gewoonlijk kort
§ WaterONoplosbare (steroïd) hormonen
o Vb testosteron
o Receptor gelokaliseerd binnenin cel " hebben juiste
eigenschappen om celmembraan te passeren
via diffusie
ð Hogere affiniteit & hoger specificiteit voor target receptoren
3) Lokale hormonen (niet?)
• Chemische signalen die werken in onmiddelijke omgeving
• Bereiken gewoonlijk eindorgaan via extracell vl
• Werken lokaal
• Snel geabsorbeerd of vernietigd
• Vb histamine uit mastcellen, prostaglandine E2
- Moleculen geven info door via interactie met receptoren op opp targetcel
- Reactie signaalmolecule (agonist/ neurotransmitter) met receptor "
conformatieverandering macromoleculaire receptor & mogelijks omliggende membraan (conf
verandering aan opp én binnenin)
è resultaat: (mebraangebonden) enzym in cel ge(de)activeerd / uitwisseling ionen tss intra- &
extracell omgeving (opening ionenkanaal)
- Agonist = product dat zelfde effect heeft als de natuurlijke molecule (neurotransmitter) "
veroorzaken zelfde cellulaire reacties
Membraangebonden enzymactivatie:
5
,- Binding ligand (agonist) " verandering conformatie receptor " actieve site (deel v receptor met
enzymatische activiteit gesloten " open)
1. Receptor niet bezet: actieve plaats gesloten " geen enzymatische activiteit
2. Boodschappermol bindt aan buitenkant receptor " conformatieverandering receptor "
enzymatisch gedeelte verandert => actieve plaats enzym toegankelijk => intracell werking
3. Substraat A omgezet nr product B " intracell veranderingen
- !! niet altijd sleutel-slot " vaak zoals hierboven: ligand & receptor veranderen conformatie
- Enzymactiviteit rechtstreeks gelinkt aan receptor: 1 geheel <-> meestal gecompliceerder (GPCRs)
- Activatie GPCR (G protein coupled receptor) " G prot w gerecruteerd nr geactiveerde receptor
" G prot activeren enzymen binnenin cel
1. Binding messenger op receptor " conformatieverandering intracell deel receptor
2. Conformatieverandering: niet rechtstreeks aan/uit " via G-prot (bolletjes) " receptoren =
G-prot gekoppeld
3. Activatie: binding G prot thv intracell zijde " door binding = verandering G prot
4. Ondergaat zelf conformatieverandering " dissociatie in 2 brokstukken
5. Brokstukken zelf: activatie enzymen (alfa-subeenheid kan binden aan enzym verankerd in
membraan)
6. Verandering conformatie enzym " activatie: inductie intracell veranderingen
è nettoresultaat = zelfde
è omweg via G-prot
6
,- Vb: noradrenaline & activatie adenylaatcyclase:
• Effect (enzymactiviteit) blijft doorgaan zolang receptor bezet is
§ Agonist niet op receptor: enzyme niet actief " ATP niet omgezet in cAMP
§ Agonist bindt aan receptor: enzyme actief " ATP => cAMP
§ Agonist lange tijd gebonden: enzymactiviteit verdwijnt weer
• cAMP: kan andere enzymatische reacties reguleren
Lock-gate mechanisme voor opening ionenkanalen
- Vb: acetylcholine & openen v ionenkanalen:
• Receptor gebonden met ionenkanaal
• Niet-gebonden (messenger): ionenkanaal gesloten
• Binding " ionenkanaal open " influx kationen in cel (volgens conc grad) " intracell
veranderingen
• Na sluiten kanaal: ionengrad hersteld door ionenpompen
• Effect kan herhaald w wnr agonist vrijgesteld is van receptor, systeem weer in originele
rusttoestand & agonist bindt weer aan receptor
• Struct ionenkanaal:
§ Ingebed in celmembraan
§ Interactie met fosfolipiden =
hydrofoob
§ Interactie met polaire
kationen/anionen = hydrofiel
7
,Hypothetische neurotransmitter en zijn receptor:
- 3 hoofdinteracties (tss boodschappermol & receptor bindingspl):
1) H-brug
2) VdW
3) Ionische binding
- Neurotransmitter: bindingsgroepen voor belangrijke interacties
• Benzeenring: voor VdW
• OH: voor H-brug
• Pos lading (amine): voor ionische binding " pos geladen (geprot) bij fysiologische pH
- Receptor: hydroxyl & carbonzuur in zijketens AZ
• OH (vb serine): H-brug
• pKa COOH ~ 5 " 100% COO- bij fysiologische pH (7,4)
- Ionische binding: interactie pos lading amine & neg lading carboxyl
- Receptor activeren: nood aan conformatieverandering " intracell effect
Induced fit:
- Eerst: groepen te ver voor goeie ionische interactie
- Conformationele verandering receptor (induced fit): groepen dichter " ionische interactie
Openen van de lock gate
- Binding aan receptor (gebonden aan ionenkanaal): ligand induceert conformatieverandering "
opening ionenkanaal
-
8
,‘echt’ voorbeeld conformatieverandering:
- Receptor kan ook ionkanaal vormen
- Prot: kn versch conformaties aannemenn
- Receptor in celmembraan:
• Intracell deel: ingebed in membraan
• Extracell deel: vormt bindingspl boodschappermol
- Brain switch
• Binding neurotransmitter (serotonine) aan tryptofaan residu (extracell deel, oranje) in
receptor " conformatieverandering die proline residu toelaat om trans-cis isomerizatie
te ondergaan
• Isomerizatie " shift locatie v alfa-helix die leucine bevat " deblokkeert ionenkanaal v
receptor (onderaan, bovenaanzicht)
• Open ionenkanaal " stroom over membraan & generatie elektrisch signaal
Spiegelbeeld van hypothetische neurotransmitter
- Spiegelbeeld: kan maar 2 interacties aangaan van de 3 " hydroxylgr verkeerd georiënteerd =>
geen interactie
- Minder affiniteit " slaagt vermoedelijk niet in activatie
- Enzymen = chiraal " leiden altijd tot stereochemisch zuivere bindingen
9
, Belang van grootte & vorm
- Kleine verandering aan ligand kan grote invloed hebben op binding
- Vb kleine methylgroep op N vervangen door propyl " molecule te groot voor bindingssite
- Structurele complementariteit nodig tss ligand & receptor !
Competiteve reversibele antagonist
- Alle nodige interacties zijn er al (vb pos lading al op juiste pl) " induceert geen
conformatieverandering " geen activatie receptor
- Eenvoudiger antagonist ontw: moet gwn goed binden " geen conformatieverandering
induceren
Partieel agonisme
- Induced fit = suboptimaal (in vgl met agonist)
- Partieel agonist kan op 2 manieren binden:
• Als agonist
• Als antagonist
- Verschillende receptoren met zelfde messenger :
• Agonist op ene subtype
• Antagonist op andere subtype
10
