Samenvatting - Practicum: biotechnologie en biochemie, Primer Design + Restrictie-enzymen (J000496A)

Practicum Primer design + RE


PCR

1/ Wat is PCR?

= Polymerase Chain Reaction

 Uitgevonden door Kary Mullis in 1983
 Doel: enorme hoeveelheden kopieën genereren van welbepaalde DNA-sequentie
 Waarom: genen = zeldzame doelwitten in complex genoom
 PCR: genoeg van gen/dna om analyse te starten

2/ Principe van PCR

 Uitgangsmateriaal PCR: DNA dat sequentie bevat die geamplificeerd dient te worden
 Reactiemengsel
o DNA-polymerase
 Enzym verantwoordelijk voor het uitvoeren vd reactie
 Gebruikt tijdens DNA-replicatie
o 2 primers: forward & reverse
o dNTPs (A, C, G, T)
 Desoxynucleotidetrifosfaten
 Bouwstenen DNA
o MgCl2
 Co-factor voor DNA-polymerase  enzym werkt optimaal
o Buffer
 Mengsel op bepaalde pH houden  reactie optimaal laten doorgaan
 3 stappen in PCR
o Denaturatie
o Annealing
o Elongatie
 1 cyclus, n keer herhalen (afh. van aantal
keer nodig)
 Denaturatie
o Reactiemengsel wordt opgewarmd tot 95°C-
96°C
o Dubbelstrengig DNA valt uiteen in 2
enkelstrengige DNA-moleculen
= Template DNA voor primers die aanhechten
 Annealing
o Mengsel wordt afgekoeld tot ongeveer 60°C (afh van primers)
o Primers aangehecht aan template-DNA
o Kort stuk dubbelstrengig DNA aanwezig, nodig voor DNA-polymerase om aan te
binden
o DNA-polymerase zal adhv. Template-DNA de complementaire basen aanbrengen
 Elongatie
o Bij 72°C : optimale T voor DNA-polymerasen om functie uit te voeren

, o Nieuwe gesynthetiseerde strengen strekken zich uit tot voorbij primer op
tegenovergestelde streng
o Er worden nieuwe primer-bindingsplaatsen gecreëerd op elk nieuw gesynthetiseerde
DNA-streng
 Na n cycli bevat de reactie een theoretisch maximum
o 2n dubbelstrengige DNA-moleculen = kopieën van DNA-sequenties tss. beide primers



3/ Primers

 Kort stuk enkelstrengig DNA, nodig om PCR reactie te starten
 Synthetisch aangemaakt
 2 primers nodig: forward & reverse
o Forward
 Bindt op backward DNA streng
 Van 3’ 5’
o Reverse
 Bindt op forward DNA streng
 Van 5’  3’
 Tm = smelttemperatuur
o Helft primer gebonden op DNA-template en de helft in het mengsel voorkomt als
enkelstrengige DNA-molecule
o Bepaalt annealing temperatuur (ideaal: 3/5°C lager dan laagste Tm vd. primers)
 Eigenschappen goede primer
o 20-30 basenparen lang
o Unieke sequentie
 Primer enkel thv. targetsequentie binnenkomen
o Ze mogen geen inverted repeats bevatten (hairpins)
 Stukje in primer waarvan de complementaire sequentie al een beetje
verder in de primer ook al voorkomt
 2 stukken binden aan elkaar want complementair  vormt hairpin/loop
 Primer kan niet meer binden op DNA-template
o Geen complementariteit tss. forward en reverse primer
 Gaan primer dimers vormen
 Binden op elkaar, niet meer beschikbaar om te binden op DNa-template
o 3’ uiteinde primer
 Rijk aan G en C
 Vormen sterkste binding met elkaar, 3 H-bruggen tov. 2 H-bruggen bij A en T
 Geen misprime: niet complementair met DNA-template (aan 3’ want elke
nieuwe DNA-streng wordt gesynthetiseerd van 5’ nr. 3’)
 Primer moet goed binden thv. 3’ uiteinde: van daaruit start elongatie
o Tm mag max. 3°C verschillen tss. forward en reverse primer
 Hechten bij dezelfde annealingtemperatuur aan het DNA-template