Biotechnologie I
1 Algemene inleiding
1.1 Definitie
Moleculaire biologie
De tak van de biologie die de “machinerie” & structuur van organismen op moleculair niveau
wil verklaren.
“machinerie”: arsenaal aan enzymen, structuur- & regulatorische eiwitten die door de cel
worden aangemaakt.
Biotechnologie
De tak binnen de biologie die gebruik maakt van DNA-manipulatie in planten, dieren,
bacteriën of andere levende wezens voor wetenschappelijk onderzoek & ontwikkeling van
medicijnen, voedsel of nieuwe stoffen.
1.2 Het genetisch materiaal & zijn eigenschappen
Om erfelijke informatie op te kunnen slaan moet een molecule voldoen aan de volgende
eigenschappen:
De molecule moet stabiel zijn
De molecule moet over een code beschikken
De molecule moet de mogelijkheid verlenen tot een nauwkeurig duplicaat van zichzelf
De informatie opgeslagen in de molecule moet tot uitdrukking gebracht & vertaald kunnen
worden
De molecule moet controle & regulatie van deze vertaling toelaten
De molecule moet de mogelijkheid tot wijzigingen toelaten
1.3 De chemische identiteit van het genetisch materiaal
De meeste organismen hebben DNA als drager van hun genetische informatie. Sommige virussen
bevatten RNA als genetisch materiaal.
DNA: biopolymeer van 4 verschillende deoxyribonucleotiden
RNA: biopolymeer van 4 verschillende ribonucleotiden
Eiwitten: biopolymeren van 20 verschillende aminozuren
1.4 De uitdrukkingswijze van het genetisch materiaal
De informatie die vervat zit in de volgorde van de deoxyribonucleotiden van het DNA wordt
weerspiegeld op RNA-niveau & uiteindelijk op eiwitniveau.
DNA RNA eiwit
1
,1.4.1 Wat is een gen?
Een DNA-fragment die de nodige genetische informatie bevat voor de vorming van 1
specifiek polypeptide.
Een promotor geeft aan
Welke cellen het eiwit moeten aanmaken
Op welk moment de cellen het eiwit moeten aanmaken
Hoeveel van dit eiwit de cellen moeten aanmaken
De activiteit van de promotor hangt af van interne & externe factoren. De promotor kan;
Sterk actief zijn
Zwak actief zijn
Sterk niet actief zijn
Gereguleerd actief zijn
Constitutief actief zijn
1.4.2 Uitdiepen centraal dogma
Schema
Gen: DNA replicatie DNA
Transcript: RNA transcriptie afhankelijk van promotoractiviteit
Maturiteit
o 5’CAP & 3’poly 1 staart zijn niet gecodeerd in het genoom
o Intron splicing: introns worden verwijderd & exons worden
vertaald matuur RNA
Stabiliteit
o Natuurlijke half-life: de natuurlijk voorkomende tijd om de
helft van het mRNA van gen X af te breken
Afhankelijk van de sequentie
Afhankelijk van translatie-intensiviteit
o Cel/ziekte-specifieke regulerende RNA: micro-RNA
Polypeptide: opvouwing & post-translationele modificaties
Proteïne (opgevouwen vorm)
2 Samenstelling van DNA & RNA
2.1 Algemene inleiding
DNA & RNA zijn opgebouwd uit 4 verschillende monomeren = nucleotiden. Een nucleotide is de
bouwsteen van nucleïnezuren & is samengesteld uit 3 delen
Stikstofhoudende heterocyclische base
Pentose
Fosfaatgroep
Onderscheid tussen nucleotide & nucleoside
2
,2.2 Stikstofhoudende heterocyclische base
2 soorten basencomponenten van DNA & RNA
Purines: adenine & guanine dubbele ringstructuren
Pyrimidines: thymine, cytosine & uracil enkele ringstructuren
2.3 De pentosen
De suikercomponent in DNA is altijd 2-deoxyribose & in RNA is het altijd ribose. De pentosemolecule
vormt de verbinding tussen de fosfaatgroep & de base. Hierbij is de 1’koolstof verbonden met
stikstof 9 van een purine of stikstof 1 van een pyrimidine.
2.4 Fosfaatgroep
Zowel in DNA als in RNA is de hydroxylgroep van koolstof 5 van de pentose veresterd met een
fosfaatgroep. Het zure karakter van de nucleotiden is dan ook te wijten aan de aanwezigheid van
deze fosfaatgroep die dissocieert onder fysiologische omstandigheden.
2.5 Nomenclatuur
4 ribonucleosiden
Adenosine
Guanosine
Cytidine
Uridine
4 2’-deoxyribonucleosiden
2’-deoxyadenosine
2’-deoxyguanosine
2’-deoxycytidine
2’-deoxythymidine
2.6 Mutaties
Mutaties kunnen ontstaan door foutief vermenigvuldigen of afschrijven van het DNA door:
Natuurlijke fouten
Onnatuurlijke fouten
Bewust ingrijpen van de biotechnoloog
Onbewust ingrijpen van de biotechnoloog
Verschillende types mutaties
Puntmutaties: 1 nucleotide veranderd
Inserties: nucleotide wordt bijgevoegd
Deletie: nucleotide wordt verwijderd
Translocaties: nucleotide wordt verplaatst
2.7 Belangrijke DNA-manipulerende enzymen & begrippen
Exonuclease Dit enzym kan nucleotiden aan het uiteinde van en DNA streng
verwijderen
Endonuclease Dit enzym is in staat om een nucleotide in de DNA/RNA-streng
te verwijderen
DNA-ligase Dit enzym is in staat op 2 verschillende dsDNA fragmenten met
elkaar te verbinden
3
, DNA polymerase Dit enzym maakt het complementaire ssDNA polymeer van een
ssDNA
RNA polymerase Dit enzym schrijft het DNA af & vormt zo een RNA transcript
DNA methylase Dit enzym hecht op een specifieke plaats een methylgroep aan
het DNA, meestal op een specifieke plaats in de basen
Alkalisch fosfatase Dit enzym verwijdert een 5’fosfaatgroep van een ds/ssDNA
streng
Polynucleotidekinase Dit enzym vervangt een 5’P door een aangeboden
gammafosfaat van een ATP molecule of voegt een 5’P toe aan
een 5’OH uiteinde
Terminaal transferase Dit enzym voegt 1 specifiek nucleotide toe aan de 3’zijde van
een DNA streng
Locus Een chromosomale regio
Allel 1 voorkomende versie van een locus of gen
Nick Een enkelstrengige breuk in dsDNA. Deze ontstaat meestal door
mechanische of chemische stress of door het specifiek gebruik
van een enzym
Shearing Het ontstaan van dubbelstrengige breuken in dsDNa. Dit
ontstaat meestal door mechanische of chemische stress
3 Structuur & eigenschappen van DNA
3.1 Primaire structuur
DNA is een polynucleotidestructuur die ontstaat door vorming van 3’-5’ fosfodiësterbindingen tussen
de nucleotiden.
Er ontstaat een suikerskelet waarop basen gebonden zijn via de koolstof 1’ van de suikermolecule.
3.2 Secundaire structuur: het Watson & Crick model
3.2.1 Twee anti parallelle polynucleotiden
Met uitzondering van enkele DNA-virussen die enkelstrengig DNA bevatten, is het genoom
opgebouwd uit 2 anti parallelle polynucleotiden, waarbij 1 keten in de 5’3’ richting loopt & de
andere in de 3’5’ richting. De ketens worden samengehouden door waterstofbruggen & hydrofobe
interacties.
De basen staan loodrecht op de suikers en zijn naar binnen georiënteerd, door de complementariteit
van de basen ontstaat de secundaire structuur. Om de 10 basenparen vind het een volledige
omwenteling plaats.
3.2.2 De basen zijn 2 aan 2 complementair
De baseparing gebeurt volgens vaste regels: A-T & G-C
Chargaff regel: aantal A + aantal G = aantal T + aantal C aantal purines = aantal pyrimidines (enkel
van toepassing bij dubbelstrengig genoom!)
4
1 Algemene inleiding
1.1 Definitie
Moleculaire biologie
De tak van de biologie die de “machinerie” & structuur van organismen op moleculair niveau
wil verklaren.
“machinerie”: arsenaal aan enzymen, structuur- & regulatorische eiwitten die door de cel
worden aangemaakt.
Biotechnologie
De tak binnen de biologie die gebruik maakt van DNA-manipulatie in planten, dieren,
bacteriën of andere levende wezens voor wetenschappelijk onderzoek & ontwikkeling van
medicijnen, voedsel of nieuwe stoffen.
1.2 Het genetisch materiaal & zijn eigenschappen
Om erfelijke informatie op te kunnen slaan moet een molecule voldoen aan de volgende
eigenschappen:
De molecule moet stabiel zijn
De molecule moet over een code beschikken
De molecule moet de mogelijkheid verlenen tot een nauwkeurig duplicaat van zichzelf
De informatie opgeslagen in de molecule moet tot uitdrukking gebracht & vertaald kunnen
worden
De molecule moet controle & regulatie van deze vertaling toelaten
De molecule moet de mogelijkheid tot wijzigingen toelaten
1.3 De chemische identiteit van het genetisch materiaal
De meeste organismen hebben DNA als drager van hun genetische informatie. Sommige virussen
bevatten RNA als genetisch materiaal.
DNA: biopolymeer van 4 verschillende deoxyribonucleotiden
RNA: biopolymeer van 4 verschillende ribonucleotiden
Eiwitten: biopolymeren van 20 verschillende aminozuren
1.4 De uitdrukkingswijze van het genetisch materiaal
De informatie die vervat zit in de volgorde van de deoxyribonucleotiden van het DNA wordt
weerspiegeld op RNA-niveau & uiteindelijk op eiwitniveau.
DNA RNA eiwit
1
,1.4.1 Wat is een gen?
Een DNA-fragment die de nodige genetische informatie bevat voor de vorming van 1
specifiek polypeptide.
Een promotor geeft aan
Welke cellen het eiwit moeten aanmaken
Op welk moment de cellen het eiwit moeten aanmaken
Hoeveel van dit eiwit de cellen moeten aanmaken
De activiteit van de promotor hangt af van interne & externe factoren. De promotor kan;
Sterk actief zijn
Zwak actief zijn
Sterk niet actief zijn
Gereguleerd actief zijn
Constitutief actief zijn
1.4.2 Uitdiepen centraal dogma
Schema
Gen: DNA replicatie DNA
Transcript: RNA transcriptie afhankelijk van promotoractiviteit
Maturiteit
o 5’CAP & 3’poly 1 staart zijn niet gecodeerd in het genoom
o Intron splicing: introns worden verwijderd & exons worden
vertaald matuur RNA
Stabiliteit
o Natuurlijke half-life: de natuurlijk voorkomende tijd om de
helft van het mRNA van gen X af te breken
Afhankelijk van de sequentie
Afhankelijk van translatie-intensiviteit
o Cel/ziekte-specifieke regulerende RNA: micro-RNA
Polypeptide: opvouwing & post-translationele modificaties
Proteïne (opgevouwen vorm)
2 Samenstelling van DNA & RNA
2.1 Algemene inleiding
DNA & RNA zijn opgebouwd uit 4 verschillende monomeren = nucleotiden. Een nucleotide is de
bouwsteen van nucleïnezuren & is samengesteld uit 3 delen
Stikstofhoudende heterocyclische base
Pentose
Fosfaatgroep
Onderscheid tussen nucleotide & nucleoside
2
,2.2 Stikstofhoudende heterocyclische base
2 soorten basencomponenten van DNA & RNA
Purines: adenine & guanine dubbele ringstructuren
Pyrimidines: thymine, cytosine & uracil enkele ringstructuren
2.3 De pentosen
De suikercomponent in DNA is altijd 2-deoxyribose & in RNA is het altijd ribose. De pentosemolecule
vormt de verbinding tussen de fosfaatgroep & de base. Hierbij is de 1’koolstof verbonden met
stikstof 9 van een purine of stikstof 1 van een pyrimidine.
2.4 Fosfaatgroep
Zowel in DNA als in RNA is de hydroxylgroep van koolstof 5 van de pentose veresterd met een
fosfaatgroep. Het zure karakter van de nucleotiden is dan ook te wijten aan de aanwezigheid van
deze fosfaatgroep die dissocieert onder fysiologische omstandigheden.
2.5 Nomenclatuur
4 ribonucleosiden
Adenosine
Guanosine
Cytidine
Uridine
4 2’-deoxyribonucleosiden
2’-deoxyadenosine
2’-deoxyguanosine
2’-deoxycytidine
2’-deoxythymidine
2.6 Mutaties
Mutaties kunnen ontstaan door foutief vermenigvuldigen of afschrijven van het DNA door:
Natuurlijke fouten
Onnatuurlijke fouten
Bewust ingrijpen van de biotechnoloog
Onbewust ingrijpen van de biotechnoloog
Verschillende types mutaties
Puntmutaties: 1 nucleotide veranderd
Inserties: nucleotide wordt bijgevoegd
Deletie: nucleotide wordt verwijderd
Translocaties: nucleotide wordt verplaatst
2.7 Belangrijke DNA-manipulerende enzymen & begrippen
Exonuclease Dit enzym kan nucleotiden aan het uiteinde van en DNA streng
verwijderen
Endonuclease Dit enzym is in staat om een nucleotide in de DNA/RNA-streng
te verwijderen
DNA-ligase Dit enzym is in staat op 2 verschillende dsDNA fragmenten met
elkaar te verbinden
3
, DNA polymerase Dit enzym maakt het complementaire ssDNA polymeer van een
ssDNA
RNA polymerase Dit enzym schrijft het DNA af & vormt zo een RNA transcript
DNA methylase Dit enzym hecht op een specifieke plaats een methylgroep aan
het DNA, meestal op een specifieke plaats in de basen
Alkalisch fosfatase Dit enzym verwijdert een 5’fosfaatgroep van een ds/ssDNA
streng
Polynucleotidekinase Dit enzym vervangt een 5’P door een aangeboden
gammafosfaat van een ATP molecule of voegt een 5’P toe aan
een 5’OH uiteinde
Terminaal transferase Dit enzym voegt 1 specifiek nucleotide toe aan de 3’zijde van
een DNA streng
Locus Een chromosomale regio
Allel 1 voorkomende versie van een locus of gen
Nick Een enkelstrengige breuk in dsDNA. Deze ontstaat meestal door
mechanische of chemische stress of door het specifiek gebruik
van een enzym
Shearing Het ontstaan van dubbelstrengige breuken in dsDNa. Dit
ontstaat meestal door mechanische of chemische stress
3 Structuur & eigenschappen van DNA
3.1 Primaire structuur
DNA is een polynucleotidestructuur die ontstaat door vorming van 3’-5’ fosfodiësterbindingen tussen
de nucleotiden.
Er ontstaat een suikerskelet waarop basen gebonden zijn via de koolstof 1’ van de suikermolecule.
3.2 Secundaire structuur: het Watson & Crick model
3.2.1 Twee anti parallelle polynucleotiden
Met uitzondering van enkele DNA-virussen die enkelstrengig DNA bevatten, is het genoom
opgebouwd uit 2 anti parallelle polynucleotiden, waarbij 1 keten in de 5’3’ richting loopt & de
andere in de 3’5’ richting. De ketens worden samengehouden door waterstofbruggen & hydrofobe
interacties.
De basen staan loodrecht op de suikers en zijn naar binnen georiënteerd, door de complementariteit
van de basen ontstaat de secundaire structuur. Om de 10 basenparen vind het een volledige
omwenteling plaats.
3.2.2 De basen zijn 2 aan 2 complementair
De baseparing gebeurt volgens vaste regels: A-T & G-C
Chargaff regel: aantal A + aantal G = aantal T + aantal C aantal purines = aantal pyrimidines (enkel
van toepassing bij dubbelstrengig genoom!)
4
