Naam: Yilska Smet Klasgroep: 3 FBT B
Datum: 28/09/2020 , 5/10/2020 en 12/10/2020
Docent: M. De Mesmaeker
Vak: Labo Biotechnologie II Nr: 10
1. DNA-concentratiebepaling via agarosegelelektroforese en fluorometrische analyse na
opzuivering en restrictie van λ-DNA- en pGEM-3Zf(+)-fragmenten via preparatieve
agarosegelelektroforese
2. Doel [1]
Een λ -DNA-fragment met bepaalde grootte wordt in de gelineariseerde vector pGEM-3Zf(+) geïntroduceerd.
De vector en het λ DNA-fragment worden verknipt door restrictie enzymen. Deze restrictie enzymen zijn
BamHI en HindIII. Vervolgens willen we de λ-DNA fragmenten en pGEM-3Zf(+)-fragmenten opzuiveren aan de
hand van een preparatieve agarosegelelektroforese. De concentratie van de opgezuiverde fragmenten wordt
bepaald via fluorometrische bepaling en via agarosegelelektroforese na kleuring met GelRed. Als DNA-merker
wordt gebruik gemaakt van λ-DNA verknipt door PstI voor de concentratiebepaling via agarosegelelektroforese.
Beide methoden worden achteraf vergeleken op basis van hun resultaten.
3. Principe [1]
De λ DNA-fragmenten en de vectorfragmenten ondergaan elk hun eigen preparatieve agarosegelektroforese,
zodat ze op een andere gel kunnen worden geladen en dus op een andere manier kunnen worden
gevisualiseerd. De agarose concentratie in de gel voor de gelelektroforese van pGEM-3Zf(+) fragmenten is 0,5%
lager dan in de gel voor λ DNA framenten, omdat deze kleinere λ DNA-fragmenten en zo dus een snellere
mobiliteit hebben dan de pGEM-3Zf (+) fragmenten.
Fragmentopzuivering van de pGEM-3Zf(+) vectorfragmenten uit de agarosegel, is een uitgesneden geldeel dat
een klein gedeelte van de lanen met de gescheiden pGEM-3Zf(+) vectorfragmenten en de fragmenten van de
merker 1kb DNA ladder bevat, gekleurd met Fast Blast DNA stain. De Fast Blast DNA Stain kan hier gebruikt
worden, omdat de lage hoeveelheid binding per aantal baseparen geen probleem vormt bij de kleuring van het
grote vectorfragment van 3167 bp. Fast Blast DNA Stain is veiliger om te hanteren en verlaagt het risico op
DNA-beschadiging door UV-belichting. Het DNA zal makkelijker gekleurd worden door het lagere
agarosegehalte van de gel. De migratieafstand van de gescheiden pGEM-3Zf(+) vectorfragmenten wordt
vergeleken met de migratieafstand van de merker 1kb DNA ladder. Nadat het uitgesneden gekleurde geldeel
teruggeplaatst wordt, kunnen de overige niet-gevisualiseerde 3167 bp-fragmenten worden geïsoleerd.
De door BamHI en HindIII verknipte λ-DNA- en pGEM-3Zf(+)-fragmenten worden na de preparatieve
agarosegelelektroforese ook opgezuiverd. Hiervoor wordt een zo minimaal mogelijk geldeel, dat het gedeelte
van de lanen met de gescheiden λ-DNA-fragmenten en de fragmenten van de merker 1kb Plus DNA ladder
bevat, uitgesneden en gekleurd via GelRed. GelRed voegt zich tussen de baseparen en zal zo oranje-rood
fluoresceren onder UV-belichting. De migratieafstand van de gescheiden λ-DNA-fragmenten wordt vergeleken
met de migratieafstand va de merker, 1kb plus DNA ladder. De nodige fragmenten worden uitgesneden,
waarna het gekleurde geldeel wordt teruggeplaatst zodat de overige niet-gevisualiseerde fragmenten van 784
bp en 493 bp kunnen worden uitgesneden. Voor de opzuivering wordt gebruik gemaakt van de PureLink® Quick
Gel Extraction Kit. De techniek is gebaseerd op het verdringen van water op de silicamembraan door middel
van een hoge zoutconcentratie om vervolgens de binding van de negatief geladen DNA-fragmenten te
bevorderen. De ongebonden fragmenten worden weggewassen en de DNA-fragmenten worden met behulp
van de elutiebuffer van de membraan verwijdert.
, Bij de fluorometrische bepaling van de DNA concentratie wordt er gebruikt gemaakt van de fluorometer. Zo
wordt er op een sensitieve en specifieke manier, de concentratie van het kleine volume van het opgezuiverde
DNA-fragment bepaald. Er wordt gebruik gemaakt van een kleurstofmolecule die specifiek aan dubbelstrenging
DNA kan binden. Dit is echter mogelijk door aan de stalen een working solution toe te voegen. De gebonden
kleurstofmoleculen worden door licht met een bepaalde golflengte geëxciteerd. De kleurstofmoleculen keren
dan teurg naar een stabielere toestand, met als gevolg warmteafgifte en geëmitteerde fluorescentielicht met
een lagere golflengte. Dit licht wordt gedetecteerd door een fotodetector en zo kan de DNA-concentratie
kwantitatief bepaald worden van een staal met een gekend volume
Het door PstI verknipte λ-DNA, dat dient als DNA-merker, wordt geëvalueerd door middel van een
agarosegelelektroforese, dit is een scheidingsmethode waarbij DNA moleculen op basis van grote van elkaar
worden gescheiden. De migratieafstand van de verknipte λ-DNA-fragmenten wordt vergeleken met de
migratieafstand van de 1kb plus DNA ladder. Bij een positieve resultaat wordt de λ-DNA-merker mee
opgenomen als standaardreeks bij de DNA-concentratie. De intensiteit van de fragmenten wordt met de
intensiteit van de fragmenten van de standaardreeks vergeleken. Indien de intensiteit vergelijkbaar is, wijst dit
op een vergelijkbare hoeveelheid DNA. DNA-concentratiebepaling is mogelijk, omdat de hoeveelheid DNA
binnen het fragmentenpatroon van de standaardreeks en het geladen volume van de opgezuiverde DNA-
fragmenten gekend is.
4. Werkwijze[1]
Voor de werkwijze wordt er verwezen naar Cursus Labo Biotechnologie II - Leen Van Houdt’ Editie 2020-2021,
pg. 9-20
Reagentia
- 1x TAE-buffer: 10 ml 50x TAE-buffer wordt aangelengd met dH2O tot 500 ml
- De restrictie-digesten zie samenstelling in het onderstaande schem
Tabel 1: overzicht Restrictiedigesten
Reagentia Digest : λ -DNA (5 µg) Digest: pGEM-3Zf(+) (1
µg)
dH2O 5 µl 19µl
λ -DNA (0,25µg/µl) 20 µl /
pGEM-3Zf(+) / 3 µl
NEBuffer 2.1 10X 3 µl 7 µl
NEBuffer 3.1 10x / /
RE: HindIII (120 U/µl) 1 µl 0,5 µl
RE: BamHI (20 U/µl) 1 µl 0,5 µl
RE: PstI (20 U/µl) / /
Eindvolume 30 µl 30 µl
- 4 agarosegels aangemaakt (zie tabel 2)
Datum: 28/09/2020 , 5/10/2020 en 12/10/2020
Docent: M. De Mesmaeker
Vak: Labo Biotechnologie II Nr: 10
1. DNA-concentratiebepaling via agarosegelelektroforese en fluorometrische analyse na
opzuivering en restrictie van λ-DNA- en pGEM-3Zf(+)-fragmenten via preparatieve
agarosegelelektroforese
2. Doel [1]
Een λ -DNA-fragment met bepaalde grootte wordt in de gelineariseerde vector pGEM-3Zf(+) geïntroduceerd.
De vector en het λ DNA-fragment worden verknipt door restrictie enzymen. Deze restrictie enzymen zijn
BamHI en HindIII. Vervolgens willen we de λ-DNA fragmenten en pGEM-3Zf(+)-fragmenten opzuiveren aan de
hand van een preparatieve agarosegelelektroforese. De concentratie van de opgezuiverde fragmenten wordt
bepaald via fluorometrische bepaling en via agarosegelelektroforese na kleuring met GelRed. Als DNA-merker
wordt gebruik gemaakt van λ-DNA verknipt door PstI voor de concentratiebepaling via agarosegelelektroforese.
Beide methoden worden achteraf vergeleken op basis van hun resultaten.
3. Principe [1]
De λ DNA-fragmenten en de vectorfragmenten ondergaan elk hun eigen preparatieve agarosegelektroforese,
zodat ze op een andere gel kunnen worden geladen en dus op een andere manier kunnen worden
gevisualiseerd. De agarose concentratie in de gel voor de gelelektroforese van pGEM-3Zf(+) fragmenten is 0,5%
lager dan in de gel voor λ DNA framenten, omdat deze kleinere λ DNA-fragmenten en zo dus een snellere
mobiliteit hebben dan de pGEM-3Zf (+) fragmenten.
Fragmentopzuivering van de pGEM-3Zf(+) vectorfragmenten uit de agarosegel, is een uitgesneden geldeel dat
een klein gedeelte van de lanen met de gescheiden pGEM-3Zf(+) vectorfragmenten en de fragmenten van de
merker 1kb DNA ladder bevat, gekleurd met Fast Blast DNA stain. De Fast Blast DNA Stain kan hier gebruikt
worden, omdat de lage hoeveelheid binding per aantal baseparen geen probleem vormt bij de kleuring van het
grote vectorfragment van 3167 bp. Fast Blast DNA Stain is veiliger om te hanteren en verlaagt het risico op
DNA-beschadiging door UV-belichting. Het DNA zal makkelijker gekleurd worden door het lagere
agarosegehalte van de gel. De migratieafstand van de gescheiden pGEM-3Zf(+) vectorfragmenten wordt
vergeleken met de migratieafstand van de merker 1kb DNA ladder. Nadat het uitgesneden gekleurde geldeel
teruggeplaatst wordt, kunnen de overige niet-gevisualiseerde 3167 bp-fragmenten worden geïsoleerd.
De door BamHI en HindIII verknipte λ-DNA- en pGEM-3Zf(+)-fragmenten worden na de preparatieve
agarosegelelektroforese ook opgezuiverd. Hiervoor wordt een zo minimaal mogelijk geldeel, dat het gedeelte
van de lanen met de gescheiden λ-DNA-fragmenten en de fragmenten van de merker 1kb Plus DNA ladder
bevat, uitgesneden en gekleurd via GelRed. GelRed voegt zich tussen de baseparen en zal zo oranje-rood
fluoresceren onder UV-belichting. De migratieafstand van de gescheiden λ-DNA-fragmenten wordt vergeleken
met de migratieafstand va de merker, 1kb plus DNA ladder. De nodige fragmenten worden uitgesneden,
waarna het gekleurde geldeel wordt teruggeplaatst zodat de overige niet-gevisualiseerde fragmenten van 784
bp en 493 bp kunnen worden uitgesneden. Voor de opzuivering wordt gebruik gemaakt van de PureLink® Quick
Gel Extraction Kit. De techniek is gebaseerd op het verdringen van water op de silicamembraan door middel
van een hoge zoutconcentratie om vervolgens de binding van de negatief geladen DNA-fragmenten te
bevorderen. De ongebonden fragmenten worden weggewassen en de DNA-fragmenten worden met behulp
van de elutiebuffer van de membraan verwijdert.
, Bij de fluorometrische bepaling van de DNA concentratie wordt er gebruikt gemaakt van de fluorometer. Zo
wordt er op een sensitieve en specifieke manier, de concentratie van het kleine volume van het opgezuiverde
DNA-fragment bepaald. Er wordt gebruik gemaakt van een kleurstofmolecule die specifiek aan dubbelstrenging
DNA kan binden. Dit is echter mogelijk door aan de stalen een working solution toe te voegen. De gebonden
kleurstofmoleculen worden door licht met een bepaalde golflengte geëxciteerd. De kleurstofmoleculen keren
dan teurg naar een stabielere toestand, met als gevolg warmteafgifte en geëmitteerde fluorescentielicht met
een lagere golflengte. Dit licht wordt gedetecteerd door een fotodetector en zo kan de DNA-concentratie
kwantitatief bepaald worden van een staal met een gekend volume
Het door PstI verknipte λ-DNA, dat dient als DNA-merker, wordt geëvalueerd door middel van een
agarosegelelektroforese, dit is een scheidingsmethode waarbij DNA moleculen op basis van grote van elkaar
worden gescheiden. De migratieafstand van de verknipte λ-DNA-fragmenten wordt vergeleken met de
migratieafstand van de 1kb plus DNA ladder. Bij een positieve resultaat wordt de λ-DNA-merker mee
opgenomen als standaardreeks bij de DNA-concentratie. De intensiteit van de fragmenten wordt met de
intensiteit van de fragmenten van de standaardreeks vergeleken. Indien de intensiteit vergelijkbaar is, wijst dit
op een vergelijkbare hoeveelheid DNA. DNA-concentratiebepaling is mogelijk, omdat de hoeveelheid DNA
binnen het fragmentenpatroon van de standaardreeks en het geladen volume van de opgezuiverde DNA-
fragmenten gekend is.
4. Werkwijze[1]
Voor de werkwijze wordt er verwezen naar Cursus Labo Biotechnologie II - Leen Van Houdt’ Editie 2020-2021,
pg. 9-20
Reagentia
- 1x TAE-buffer: 10 ml 50x TAE-buffer wordt aangelengd met dH2O tot 500 ml
- De restrictie-digesten zie samenstelling in het onderstaande schem
Tabel 1: overzicht Restrictiedigesten
Reagentia Digest : λ -DNA (5 µg) Digest: pGEM-3Zf(+) (1
µg)
dH2O 5 µl 19µl
λ -DNA (0,25µg/µl) 20 µl /
pGEM-3Zf(+) / 3 µl
NEBuffer 2.1 10X 3 µl 7 µl
NEBuffer 3.1 10x / /
RE: HindIII (120 U/µl) 1 µl 0,5 µl
RE: BamHI (20 U/µl) 1 µl 0,5 µl
RE: PstI (20 U/µl) / /
Eindvolume 30 µl 30 µl
- 4 agarosegels aangemaakt (zie tabel 2)
