MOLECULAIRE BIOLOGIE
HOOFDSTUK 11
NUCLEÏNEZUURSTRUCTUUR, DNA REPLICATIE EN CHROMOSOOMSTRUCTUUR
11.1 Identificatie van het genetisch materiaal
DNA draagt de genetische instructies voor de fysieke karakteristieken van levende organismen. Om
deze rol te kunnen vervullen, moet het DNA voldoen aan een aantal sleutelvoorwaarden:
Informatie: het genetisch materiaal moet de informatie dragen nodig voor het maken van een
volledig organisme.
Transmissie: wanneer het genetisch materiaal gerepliceerd is, kan het doorgegeven worden
van ouder tot nakomeling. Het moet ook doorgegeven worden van cel tot cel tijdens het proces
van celdeling.
Replicatie: het genetisch materiaal moet gekopieerd worden.
Variatie: verschillen in het genetisch materiaal moeten zorgen voor de gekende variatie tussen
verschillende soorten en tussen soorten onderling.
Biochemische identificatie van het erfelijk materiaal?
1833: Weisman en Nägeli stelden dat er een chemische substatie bestaat die verantwoordelijk
is voor overdracht van eigenschappen tussen generaties.
Rond 1900: men nam algemeen aan dat chromosomen het genetisch materiaal bevatten
("chromosoom": "chromo" en "soma": betekent letterlijk gekleurd lichaam, verwijst naar de eerdere
onderzoeken met kleurstoffen)
Door het bestuderen van de transmissiepatronen van chromosomen van cel tot cel en van
ouder tot nakomeling, waren wetenschappers ervan overtuigd dat chromosomen de bepalende
factoren dragen die zorgen voor de karakteristieke eigenschappen van een organisme.
Chromosomen dragen 2 soorten macromoleculen: DNA en proteïnen. In eerste instantie waren
wetenschappers ervan overtuigd dat proteïnen het genetisch materiaal dragen, omdat deze
biochemisch een meer complexe structuur hebben.
Experiment van Griffith
Griffith bestudeerde in de late jaren 1920 een type bacterie (Streptococcus pneumoniae). Er zijn 2
stammen van deze bacterie:
1 stam secreteert een polysaccharidekapsel: Smooth (S) wegens morfologie kolonie op agar
bodem.
1 stam secreteert dit kapsel niet: Rough CR)
Type S veroorzaakt longontsteking en andere symptomen bij zoogdieren, bij muizen is deze infectie
dodelijk bij injectie: deze bacterie is virulent: het kapsel voorkomt dat het immuunsysteem de bacterie
kan doden. Type R doodt muizen niet (geen kapsel).
Mengsel van type R met door hitte gedode type S doodt de muizen wel.
Griffith noemde dit transformatie (hij veronderstelde dat een substantie van het dode type S
transformeerde in type R).
Conclusie van Griffith:
Er is een substantie de wordt overgebracht van dode naar levende organismen.
Deze substantie veroorzaakt transformatie van de bacteriën.
Men kon nog niet uitmaken wat de biochemische samenstelling was van die substantie.
Moleculaire Biologie - Acjr. 2011-2012
, De 4 voorwaarden voor DNA toegepast op dit experiment:
Informatie: de getransformeerde bacteriën hebben de informatie verkregen van de cellen
gedood door hitte, om een capsule te maken (substantie).
Replicatie: de substantie die het mogelijk maakt om een capsule te maken, moet gerepliceerd
worden, en daarna ...
Transmissie: ... doorgegeven worden.
Variatie: Griffith had al door dat variatie bestond (type S en type R).
Uit deze conversaties kan men dus concluderen dat de vorming van een capsule (of net niet)
gecontroleerd wordt door genetisch materiaal.
Experiment van Avery, MacLeod en McCarty
Toonden aan dat DNA het genetisch materiaal is.
Welk biochemisch materiaal wordt er doorgegeven?
Experiment uitgevoerd in de jaren 1940: onderzochten bacteriële transformatie, zuiverden DNA, RNA
en eiwitten op en ontdekten dan dat alleen DNA transformeert.
! Was het DNA-extract 100% zuiver?
! Kunnen contamineren de stoffen (RNA/eiwit) het genetisch materiaal zijn?
Experiment:
Hypothese: een bepaalde macromolecule van type S bacterie, wat als genetisch materiaal
functioneert, heeft de mogelijkheid om type R te veranderen in type S.
Materiaal: type R- en type S-streng van Streptococcus pneumoniae.
Experiment:
1. DNA van type S nemen (cellen openbreken en DNA scheiden van andere componenten
door centrifugatie).
2. DNA-extract mengen met type R bacteriën + DNase, RNase of protease (enzymen:
verteren resp. DNA, RNA en eiwitten) en een controleproefbuis.
3. antilichaam toevoegen, dat specifiek type R cellen herkent die niet getransformeerd zijn.
4. centrifugatie: type S in supernatant, type R in pellet.
Data:
• Controle: I
• DNA-extract: reactie
• DNA-extract + DNase: geen reactie
DNA-extract + RNase: reactie
(DNA is afgebroken, type R kan dus niet meer transformeren)
• DNA-extract + protease: reactie
Conclusie: DNA is genetisch materiaal.
Moleculaire Biologie - Acjr. 2011-2012 2
, Experiment van Hersheyen Chase
Toonden aan dat DNA het genetisch materiaal is van bacteriofaag T2.
(Bacterio )faag: virus of bacterie dat een bacterie infecteert.
(in dit geval: virus T2 infecteert bacteriële cellen, nl. Escherichia coliï
1952
Is het gebruik van DNA als erfelijk materiaal verspreid in de biologie?
Experiment met bacteriofaag T2
DNA wordt in het hoofdgedeelte van T2 gevonden.
Om te kunnen repliceren, moeten alle virussen hun genetisch materiaal in het cytoplasma van een
levende gastcel injecteren. In het geval van T2 houdt dit het aanhechten aan de bacteriële celwand in.
In die tijd was niet geweten ofhet nu DNA of eiwitten waren die de faag injecteerde.
Om te bepalen of DNA het genetisch materiaal van T2 is, kwamen Hersheyen Chase met een methode
om het kapsel van de faag, welke bevestigd is aan de buitenzijde van de bacterie, te scheiden van het
genetisch materiaal, welke in het cytoplasma geïnjecteerd zit:
Zwavel atomen worden gevonden in faagproteïnen, maar niet in DNA, terwijl fosforatomen in DNA
worden gevonden, maar niet in faagproteïnen.
Experiment:
Men stelden T2-geïnfecteerde bacteriële cellen bloot aan 35S en 32p, in blender gebracht, waardoor de
mantel van de faag werd verwijderd. Daarna gecentrifugeerd, resultaat: de zwaardere bacteriële cellen
vormden een pellet, de lichteren mantels van de fagen zaten in het supernatant. De hoeveelheid
radioactiviteit werd dan gemeten m.b.V. een Geigerteller: het meeste van de 35S zat in het supernatant,
wat wil zeggen dat de lege mantels voornamelijk proteïnen bevatten.
In tegenstelling tot slechts de 35% van het 32p dat gevonden werd in het supernatant, wat dus wil
zeggen dat het DNA te vinden was in het pellet.
Conclusie: het DNA van de faag wordt geïnjecteerd in het bacteriële cytoplasma en is dus het
genetisch materiaal.
11.2 Nucleïnezuur structuur
Een belangrijk principe in de microbiologie stelt dat structuur de functie bepaalt. Wanneer
wetenschappers dus de functie van een bepaald materiaal op moleculair en cellulair niveau willen
begrijpen, focussen ze zich op de biochemische structuur van de stof.
DNA en RNA zijn gekend al nucleïnezuren, zijn zure moleculen (d.w.z. dat ze Hl-ionen in oplossing
vrijlaten en een netto negatieve lading hebben)
DNA = geoxyribogucleic ~cid
RNA = ribonucleic acid
Moleculaire Biologie - Acjr. 2011-2012 3
, DNA is een hele grote macromolecule, opgebouwd uit verschillende componenten. We kunnen deze
structurele bouwstenen beschouwen op verschillende niveaus van complexiteit:
nucleotiden zijn de bouwstenen van DNA (en RNA).
een DNA (ofRNA)-streng ontstaat door de lineaire vorming van covalente bindingen tussen
de verschillende nucleotiden
twee strengen kunnen onderling waterstofbruggen vormen om een dubbele helix te vormen
in 1evende cellen wordt DNA geassocieerd met een streng van proteïnen, die zo
chromosomen vormen
een genoom is de volledige verzameling aan genetisch materiaal in een organisme. Het
genoom van de meeste bacteriën is een enkelvoudig circulair chromosoom, terwijl eukaryote
cellen DNA, mitochondriën en chloroplasten hebben in hun nucleus.
Een nucleotide bestaat uit 3 componenten: een fosfaatgroep, een suiker (vijfring) en een stikstofbase.
De nucleotiden in DNA en RNA bevatten verschillende suikers: Deoxyribose wordt in DNA
gevonden, terwijl ribose in RNA gevonden wordt.
~ De base en fosfaatgroep hangen aan verschillende kanten vast aan de suikermolecule.
De vijf verschillende basen zijn onderverdeeld in 2 categorieën: de purines en de pyrimidines. De
purinebasen zijn adenine (A) en guanine (G), en hebben een dubbele-ringstructuur. De pyrimidines
zijn thymine (T), cytosine (C) en uracil (U), en hebben een enkele-ringstructuur. Adenine, guanine, en
cytosine worden alle drie in zowel DNA als RNA gevonden. Thymine wordt enkel in DNA gevonden,
en uracil wordt enkel in RNA gevonden.
Een conventioneel nummeringsysteem beschrijft de precieze locatie van de koolstof- en
stikstofatomen in de suikers en basen.
In de suikerring zijn de koolstofatomen in een wijzerzin genummerd, startend vanaf het koolstofatoom
rechts van het zuurstofatoom in de ring. Het vijfde koolstofatoom staat buiten de ring. Een base wordt
vastgemaakt aan het l' koolstofatoom, de fosfaatgroep aan de 5' koolstofatoom.
Vergeleken met ribose, mist deoxyribose een zuurstofatoom op de 2' positie.
DNA- en RNA-strengen worden ook wel fosfosdiësterbindingen genoemd. De fosfaat- en
suikermolecules vormen de backbone, terwijl de basen uit de ruggengraat steken. De backbone is
negatief geladen door de fosfaatgroepen.
Oriëntatie is belangrijk: elke fosfaat in een fosfodiësterbinding is covalent gebonden aan het 5'
koolstofatoom in de ene nucleotide en aan het 3' koolstofatoom in de andere. In een streng zijn alle
~ suikermoleculen in dezelfde richting georiënteerd.
DUS: fosfodiësterbinding 5' -7 3' oriëntatie
5' -eind: fosfaatgroep
3' -eind: OH-groep
Hoe werd de structuur van DNA bepaald?
James Watson en Francis Crick hebben de structuur van DNA bepaald. Ze hebben hun ondervindingen
gebaseerd op de stellingen van Rosalind Franklin. Met behulp van X-stralen diffractie kon zij stellen
dat DNA uit een helix structuur bestaat, een uniforme diameter heeft, uit meer dan 1 streng bestaat
(want de structuur is te breed voor 1 streng), een bepaald aantal basen heeft per draai, met 2 nm
tussenruimte (later werd dit verklaard door verschil in grootte tussen de purines en pyrimidines).
Erwin Chargaff analyseerde dan weer de basensamenstelling in DNA. Hij kwam tot de conclusie dat
de hoeveelheid adenine altijd gelijk is aan de hoeveelheid thymine, en de hoeveelheid cytosine is altijd
gelijk aan de hoeveelheid guanine.
Moleculaire Biologie - Acjr. 2011-2012 4
HOOFDSTUK 11
NUCLEÏNEZUURSTRUCTUUR, DNA REPLICATIE EN CHROMOSOOMSTRUCTUUR
11.1 Identificatie van het genetisch materiaal
DNA draagt de genetische instructies voor de fysieke karakteristieken van levende organismen. Om
deze rol te kunnen vervullen, moet het DNA voldoen aan een aantal sleutelvoorwaarden:
Informatie: het genetisch materiaal moet de informatie dragen nodig voor het maken van een
volledig organisme.
Transmissie: wanneer het genetisch materiaal gerepliceerd is, kan het doorgegeven worden
van ouder tot nakomeling. Het moet ook doorgegeven worden van cel tot cel tijdens het proces
van celdeling.
Replicatie: het genetisch materiaal moet gekopieerd worden.
Variatie: verschillen in het genetisch materiaal moeten zorgen voor de gekende variatie tussen
verschillende soorten en tussen soorten onderling.
Biochemische identificatie van het erfelijk materiaal?
1833: Weisman en Nägeli stelden dat er een chemische substatie bestaat die verantwoordelijk
is voor overdracht van eigenschappen tussen generaties.
Rond 1900: men nam algemeen aan dat chromosomen het genetisch materiaal bevatten
("chromosoom": "chromo" en "soma": betekent letterlijk gekleurd lichaam, verwijst naar de eerdere
onderzoeken met kleurstoffen)
Door het bestuderen van de transmissiepatronen van chromosomen van cel tot cel en van
ouder tot nakomeling, waren wetenschappers ervan overtuigd dat chromosomen de bepalende
factoren dragen die zorgen voor de karakteristieke eigenschappen van een organisme.
Chromosomen dragen 2 soorten macromoleculen: DNA en proteïnen. In eerste instantie waren
wetenschappers ervan overtuigd dat proteïnen het genetisch materiaal dragen, omdat deze
biochemisch een meer complexe structuur hebben.
Experiment van Griffith
Griffith bestudeerde in de late jaren 1920 een type bacterie (Streptococcus pneumoniae). Er zijn 2
stammen van deze bacterie:
1 stam secreteert een polysaccharidekapsel: Smooth (S) wegens morfologie kolonie op agar
bodem.
1 stam secreteert dit kapsel niet: Rough CR)
Type S veroorzaakt longontsteking en andere symptomen bij zoogdieren, bij muizen is deze infectie
dodelijk bij injectie: deze bacterie is virulent: het kapsel voorkomt dat het immuunsysteem de bacterie
kan doden. Type R doodt muizen niet (geen kapsel).
Mengsel van type R met door hitte gedode type S doodt de muizen wel.
Griffith noemde dit transformatie (hij veronderstelde dat een substantie van het dode type S
transformeerde in type R).
Conclusie van Griffith:
Er is een substantie de wordt overgebracht van dode naar levende organismen.
Deze substantie veroorzaakt transformatie van de bacteriën.
Men kon nog niet uitmaken wat de biochemische samenstelling was van die substantie.
Moleculaire Biologie - Acjr. 2011-2012
, De 4 voorwaarden voor DNA toegepast op dit experiment:
Informatie: de getransformeerde bacteriën hebben de informatie verkregen van de cellen
gedood door hitte, om een capsule te maken (substantie).
Replicatie: de substantie die het mogelijk maakt om een capsule te maken, moet gerepliceerd
worden, en daarna ...
Transmissie: ... doorgegeven worden.
Variatie: Griffith had al door dat variatie bestond (type S en type R).
Uit deze conversaties kan men dus concluderen dat de vorming van een capsule (of net niet)
gecontroleerd wordt door genetisch materiaal.
Experiment van Avery, MacLeod en McCarty
Toonden aan dat DNA het genetisch materiaal is.
Welk biochemisch materiaal wordt er doorgegeven?
Experiment uitgevoerd in de jaren 1940: onderzochten bacteriële transformatie, zuiverden DNA, RNA
en eiwitten op en ontdekten dan dat alleen DNA transformeert.
! Was het DNA-extract 100% zuiver?
! Kunnen contamineren de stoffen (RNA/eiwit) het genetisch materiaal zijn?
Experiment:
Hypothese: een bepaalde macromolecule van type S bacterie, wat als genetisch materiaal
functioneert, heeft de mogelijkheid om type R te veranderen in type S.
Materiaal: type R- en type S-streng van Streptococcus pneumoniae.
Experiment:
1. DNA van type S nemen (cellen openbreken en DNA scheiden van andere componenten
door centrifugatie).
2. DNA-extract mengen met type R bacteriën + DNase, RNase of protease (enzymen:
verteren resp. DNA, RNA en eiwitten) en een controleproefbuis.
3. antilichaam toevoegen, dat specifiek type R cellen herkent die niet getransformeerd zijn.
4. centrifugatie: type S in supernatant, type R in pellet.
Data:
• Controle: I
• DNA-extract: reactie
• DNA-extract + DNase: geen reactie
DNA-extract + RNase: reactie
(DNA is afgebroken, type R kan dus niet meer transformeren)
• DNA-extract + protease: reactie
Conclusie: DNA is genetisch materiaal.
Moleculaire Biologie - Acjr. 2011-2012 2
, Experiment van Hersheyen Chase
Toonden aan dat DNA het genetisch materiaal is van bacteriofaag T2.
(Bacterio )faag: virus of bacterie dat een bacterie infecteert.
(in dit geval: virus T2 infecteert bacteriële cellen, nl. Escherichia coliï
1952
Is het gebruik van DNA als erfelijk materiaal verspreid in de biologie?
Experiment met bacteriofaag T2
DNA wordt in het hoofdgedeelte van T2 gevonden.
Om te kunnen repliceren, moeten alle virussen hun genetisch materiaal in het cytoplasma van een
levende gastcel injecteren. In het geval van T2 houdt dit het aanhechten aan de bacteriële celwand in.
In die tijd was niet geweten ofhet nu DNA of eiwitten waren die de faag injecteerde.
Om te bepalen of DNA het genetisch materiaal van T2 is, kwamen Hersheyen Chase met een methode
om het kapsel van de faag, welke bevestigd is aan de buitenzijde van de bacterie, te scheiden van het
genetisch materiaal, welke in het cytoplasma geïnjecteerd zit:
Zwavel atomen worden gevonden in faagproteïnen, maar niet in DNA, terwijl fosforatomen in DNA
worden gevonden, maar niet in faagproteïnen.
Experiment:
Men stelden T2-geïnfecteerde bacteriële cellen bloot aan 35S en 32p, in blender gebracht, waardoor de
mantel van de faag werd verwijderd. Daarna gecentrifugeerd, resultaat: de zwaardere bacteriële cellen
vormden een pellet, de lichteren mantels van de fagen zaten in het supernatant. De hoeveelheid
radioactiviteit werd dan gemeten m.b.V. een Geigerteller: het meeste van de 35S zat in het supernatant,
wat wil zeggen dat de lege mantels voornamelijk proteïnen bevatten.
In tegenstelling tot slechts de 35% van het 32p dat gevonden werd in het supernatant, wat dus wil
zeggen dat het DNA te vinden was in het pellet.
Conclusie: het DNA van de faag wordt geïnjecteerd in het bacteriële cytoplasma en is dus het
genetisch materiaal.
11.2 Nucleïnezuur structuur
Een belangrijk principe in de microbiologie stelt dat structuur de functie bepaalt. Wanneer
wetenschappers dus de functie van een bepaald materiaal op moleculair en cellulair niveau willen
begrijpen, focussen ze zich op de biochemische structuur van de stof.
DNA en RNA zijn gekend al nucleïnezuren, zijn zure moleculen (d.w.z. dat ze Hl-ionen in oplossing
vrijlaten en een netto negatieve lading hebben)
DNA = geoxyribogucleic ~cid
RNA = ribonucleic acid
Moleculaire Biologie - Acjr. 2011-2012 3
, DNA is een hele grote macromolecule, opgebouwd uit verschillende componenten. We kunnen deze
structurele bouwstenen beschouwen op verschillende niveaus van complexiteit:
nucleotiden zijn de bouwstenen van DNA (en RNA).
een DNA (ofRNA)-streng ontstaat door de lineaire vorming van covalente bindingen tussen
de verschillende nucleotiden
twee strengen kunnen onderling waterstofbruggen vormen om een dubbele helix te vormen
in 1evende cellen wordt DNA geassocieerd met een streng van proteïnen, die zo
chromosomen vormen
een genoom is de volledige verzameling aan genetisch materiaal in een organisme. Het
genoom van de meeste bacteriën is een enkelvoudig circulair chromosoom, terwijl eukaryote
cellen DNA, mitochondriën en chloroplasten hebben in hun nucleus.
Een nucleotide bestaat uit 3 componenten: een fosfaatgroep, een suiker (vijfring) en een stikstofbase.
De nucleotiden in DNA en RNA bevatten verschillende suikers: Deoxyribose wordt in DNA
gevonden, terwijl ribose in RNA gevonden wordt.
~ De base en fosfaatgroep hangen aan verschillende kanten vast aan de suikermolecule.
De vijf verschillende basen zijn onderverdeeld in 2 categorieën: de purines en de pyrimidines. De
purinebasen zijn adenine (A) en guanine (G), en hebben een dubbele-ringstructuur. De pyrimidines
zijn thymine (T), cytosine (C) en uracil (U), en hebben een enkele-ringstructuur. Adenine, guanine, en
cytosine worden alle drie in zowel DNA als RNA gevonden. Thymine wordt enkel in DNA gevonden,
en uracil wordt enkel in RNA gevonden.
Een conventioneel nummeringsysteem beschrijft de precieze locatie van de koolstof- en
stikstofatomen in de suikers en basen.
In de suikerring zijn de koolstofatomen in een wijzerzin genummerd, startend vanaf het koolstofatoom
rechts van het zuurstofatoom in de ring. Het vijfde koolstofatoom staat buiten de ring. Een base wordt
vastgemaakt aan het l' koolstofatoom, de fosfaatgroep aan de 5' koolstofatoom.
Vergeleken met ribose, mist deoxyribose een zuurstofatoom op de 2' positie.
DNA- en RNA-strengen worden ook wel fosfosdiësterbindingen genoemd. De fosfaat- en
suikermolecules vormen de backbone, terwijl de basen uit de ruggengraat steken. De backbone is
negatief geladen door de fosfaatgroepen.
Oriëntatie is belangrijk: elke fosfaat in een fosfodiësterbinding is covalent gebonden aan het 5'
koolstofatoom in de ene nucleotide en aan het 3' koolstofatoom in de andere. In een streng zijn alle
~ suikermoleculen in dezelfde richting georiënteerd.
DUS: fosfodiësterbinding 5' -7 3' oriëntatie
5' -eind: fosfaatgroep
3' -eind: OH-groep
Hoe werd de structuur van DNA bepaald?
James Watson en Francis Crick hebben de structuur van DNA bepaald. Ze hebben hun ondervindingen
gebaseerd op de stellingen van Rosalind Franklin. Met behulp van X-stralen diffractie kon zij stellen
dat DNA uit een helix structuur bestaat, een uniforme diameter heeft, uit meer dan 1 streng bestaat
(want de structuur is te breed voor 1 streng), een bepaald aantal basen heeft per draai, met 2 nm
tussenruimte (later werd dit verklaard door verschil in grootte tussen de purines en pyrimidines).
Erwin Chargaff analyseerde dan weer de basensamenstelling in DNA. Hij kwam tot de conclusie dat
de hoeveelheid adenine altijd gelijk is aan de hoeveelheid thymine, en de hoeveelheid cytosine is altijd
gelijk aan de hoeveelheid guanine.
Moleculaire Biologie - Acjr. 2011-2012 4
